임상 및 MRI 다발성경화증 활성도와 Human Endogenous Retrovirus Type W 및 Herpesvirus의 발현 비교

배경/근거:

다발성 경화증(MS)은 척수(특히 후척수)에 영향을 미치는 염증성 탈수초성 질환입니다. MS의 임상적 이질성은 잘 설명되어 있지만 현재 MS의 병변과 중추신경계(CNS)의 병리학적 파괴에 관여하는 기본 메커니즘도 이질적이라는 것이 알려져 있습니다. 그것은 하나의 면역병원성 기전이 수초의 파괴에 책임이 있는 것으로 제안되는 다인자 질병입니다.

그러나 MS의 염증성 관절 병변의 병리학은 CNS 미엘린 성분에 대한 특정 자가면역 반응이 미엘린 파괴에 결정적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이 개념은 MHC(major histocompatibility complex)의 위치와의 연결, MS 병변에서 수초에 반응하는 B 및 T 세포의 확장 및 미엘린 단백질은 동물에서 MS 유사 질병인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도합니다.

미엘린 염기성 단백질, 단백지질 단백질, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)의 미엘린 관련 당단백질을 포함한 다양한 미엘린 단백질에 대한 자가반응성이 다발성 경화증 환자에서 관찰되었습니다.

그러나 다발성 경화증 환자의 T 세포는 다른 수초 단백질과 관련하여 MOG에 대해 우세한 활성을 나타내며 항-MOG 항체는 다발성 경화증의 급성 병변에서 축색 돌기 주위의 수초 붕괴와 관련이 있는 것으로 확인되었습니다. 또한, MOG를 사용한 민감화는 설치류 모델 및 영장류에서 MS의 임상 및 탈수초성 퇴행성 병리를 재현합니다.

MS의 감염성 병인도 가정되었으며, 수년에 걸쳐 면역 병리학을 유발하는 다양한 바이러스가 제안되었습니다. EBV, 수두 대상 포진 바이러스 및 풍진 바이러스에 대한 항체의 이름이 증가한 반면 특히 HERV-W 계열의 특정 단백질 인간 내인성 레트로 바이러스(HERV)가 다발성 경화증 환자의 혈액 및 뇌 병변에서 검출되었습니다.

HERV는 외인성 레트로바이러스에 의한 생식계열의 숙주 세포의 고대 감염에서 발생했으며 오늘날 인간 게놈의 약 8%를 구성합니다.

레트로바이러스 다발성 경화증 관련(MRSV)은 HERV-W 계열 인간 게놈의 원형을 나타내는 역전사 효소 활성을 가진 외피가 있는 바이러스입니다.

MRSV는 연수막, 맥락총 및 MS 환자의 단핵구/대식세포 배양에서 분리되었으며 그 기원은 아직 조사 중입니다. 입자는 변형된 MSRV 프로바이러스 HERV-W에서 유래하거나 동일한 외인성 패밀리의 구성원으로부터 전달되는 것으로 제안되었습니다. MSRV 비리온은 초항원과 같은 특성을 가지고 있으며 말초 인간 혈액에서 단핵 세포에 의한 사이토카인 생성을 유도합니다.

역전사효소 활성(RT)과 관련된 HERV 입자는 MSRV 발현의 특징인 것으로 확인되었습니다. RT PCR에 의한 MSRV 비리온 검출을 위한 프로토콜은 환자의 혈청 및 뇌척수액(CSF)에서 이들의 존재를 검출하도록 설계되었습니다.

MS 환자와 대조군 집단에 대한 독립적인 연구는 MS와 MSRV 및 이차 진행성 형태(SP-MS)에서 재발-완화 MS의 전환을 포함하여 이의 예후 사이의 상관관계를 보여주었습니다.

병렬 연구는 MSRV 비리온의 면역병인을 보여주고 MSRV의 엔벨로프 단백질(Env)이 전염증성 및 초항원성 면역을 담당하는 것으로 확인했습니다. Env 항원은 뇌 사후 연구에서 MS 환자에게서 검출되었습니다.

MS와 관련된 환경 바이러스에 의한 HERV-W 프로모터의 트랜스-활성화는 또한 숙주 게놈에 존재할 때 HERV-W에서 후생유전학적 조절곤란을 유도하는 것으로 나타났습니다.

확실히 MS와 관련된 가장 중요한 헤르페스 바이러스는 EBV이며, EBV 혈청과 MS 발달 사이의 비율이 광범위하게 연구되었습니다. 또한, EBV와 면역계 사이의 상호 작용은 부인할 수 없이 지속적인 면역 반응과 림프구의 불멸화로 이어집니다. EBV의 발현과 MS의 더 큰 활동을 연관시키는 연구도 있습니다. 마지막으로, EBV와 내인성 레트로바이러스 사이의 상호작용은 최근의 매력적인 연구 분야입니다.

EBV는 1971년에 MS의 잠재적 원인으로 연루된 Herpesviridae 과의 첫 번째 구성원이었습니다. EBV는 몇 가지 요인으로 인해 가능한 후보입니다. 자연계에 널리 퍼져 있고, 재활성화 기간으로 인해 지속적으로 생산되는 장기간의 정지 바이러스 감염이 필요하며 인간 면역 체계를 조절합니다.

EBV가 자가면역 질환이 발병하기 전에 발생한 바이러스 감염임을 증명하기 위해 MS를 연관시키는 데 어려움이 있었습니다. Pohl et al. 유럽의 다발성 경화증 환자(소아)에서 EBV 혈청 양성 반응은 바이러스 항체가 72%에서 발견된 대조군과 비교했을 때 99% 더 높았습니다.

Levinet al. MS 전에 혈청 항체 역가로 바이러스 감염 시간을 추정하고 대조군과 비교했습니다. 이 연구는 혈액 샘플을 보관하고 있는 약 800만 명의 미군 직원의 의료 기록에 접근할 수 있었습니다. 이 그룹에서 305명이 나중에 다발성 경화증을 발병하게 된 환자-대조군 연구와 선택된 610명의 대조군이 짝을 이루었습니다. MS가 발생한 10예와 대조군 32예는 처음에 EBV 혈청 음성이었습니다. 혈청 전환된 대조군의 35.7%와 비교하여 모든 경우는 MS 이전에 양성 EBV가 되었습니다.

다른 연구에서도 EBV에 대한 항체 역가와 MS 발병 사이의 관계를 평가하려고 시도했습니다. De Lorenze 등의 연구에 따르면 MS 환자는 MS의 첫 증상이 나타나기 20년 전에 항체가 상당히 증가했습니다. 이 사실은 두 가지 방식으로 설명될 수 있습니다: EBV 수용체 세포(기억 T 세포)의 균형을 바꾸는 이전 감염의 존재 또는 다른 EBV 균주로의 재감염.

EBV는 B 림프구를 감염시키고 지속적으로 면역원성이 높습니다. 항원 특이적 세포독성 T 림프구는 일차 감염 및 높은 바이러스혈증에 반응하여 지속적으로 생성되고 그 수가 증가합니다. 이 면역 조절은 EBV 관련 악성 종양을 예방하는 데 필수적입니다. 조절 작용에서 잠복 항원의 발현을 통해 감염된 B 림프구를 구제하고 바이러스가 지속되는 기억 B 세포로 분화하도록 돕습니다. 그러나 EBV에 특이적인 증가된 T 세포가 미엘린 항원의 특이적인 인식에 의한 증가된 자극에 대한 반응인지 여부는 확립되지 않았습니다. EBV 바이러스 부하는 MS에서 그다지 높지 않으며, 또한 이 바이러스에 특이적인 T 세포는 MS가 없는 숙주에서 동일한 세포와 ​​구별되지 않는 것 같습니다.

또 다른 연구자는 MS 재활성화 기간 동안 차도 기간과 관련하여 바이러스 복제 활동이 증가한다고 말합니다. EBV의 조기 항원에 대한 항체 반응이 있는 환자는 체액성 반응이 없는 환자와 비교할 때 가돌리늄 MRI로 측정한 질병 활동을 보일 가능성이 더 높습니다. 이러한 데이터를 통해 우리는 질병의 활동이 잠복 EBV 감염 및 질병 진행과 관련이 있을 수 있다고 믿게 되었습니다.

사이토메갈로바이러스(CMV)와 MS에 대한 항체 수준의 상관 관계에 대한 연구는 논란의 여지가 있습니다. 대부분의 결과가 다발성 경화증 환자에서 높은 CMV 감염률을 보여주지만, 반면에 질병의 경미한 발현이 관찰됩니다.

일부 연구자들은 MS 및 건강한 개인에서 항-CMV 항체의 존재를 찾았습니다. 그들은 대조군에서 52%와 비교하여 MS 환자의 98%에서 양성을 발견했습니다.

또 다른 조사자들은 CMV에 대한 항체를 가진 환자들이 다음과 같다는 것을 보여주었습니다: 질병 발병 연령이 늦고, 질병의 재활성화 비율이 낮고, MRI에서 뇌 위축의 징후가 적습니다. 이 항체의 역가가 높은 사람들은 역가가 낮은 환자들에 비해 영상 검사에서 뇌 위축이 적고 병변이 적었습니다. MS의 패턴을 모방한 동물 모델은 임상 프리젠테이션 전에 프레임을 탈수초화하는 CMV 감염이 있는 동물이 감염되지 않은 동물보다 약하다는 것을 입증했습니다. 이러한 연구는 MS의 면역 반응에 대한 CMV 감염의 유익한 조절 효과를 시사합니다.

헤르페스 바이러스(HHV-6 및 HHV-7)는 밀접하게 관련되어 있으며 유사한 생물학적 패턴을 가지고 있습니다. 이 바이러스는 면역 체계의 세포를 감염시키고 그 기능을 조절할 수 있습니다. Krukle-Nora et al. 환자의 말초 혈액을 분석하여 MS에서 HHV-6과 HHV-7 사이의 연관성을 조사하려고 시도했습니다. 환자를 무작위로 선택하여 2개 그룹으로 나누었습니다: 재발 완화성 MS(RR-MS) 환자 14명과 이차 진행성 MS(SP-MS) 환자 14명. 모든 연구 환자는 최소 3개월 동안 면역억제제를 사용하지 않았습니다. 28명의 환자 중 25명은 잠복 HHV-6 감염 및/또는 HHV-7 감염이 있었습니다. HHV-6은 RR-MS 환자 9명과 SP-MS 환자 9명에서 발견되었습니다. HHV-7은 RR-MS 환자 10명과 SP-MS 환자 14명에서 발견되었습니다.

형광 in situ hybridization 기술을 사용하는 두 명의 조사관은 MS 환자의 영향을 받은 조직과 질병이 없는 뇌 샘플에서 백질에서 초기 및 후기 바이러스 유전자의 발현을 평가하기 위해 인간 사체 조직을 검사했습니다. HHV-6의 유전자는 모든 샘플에서 발견되었으며 희소돌기아교세포로 제한되었습니다. 바이러스 RNA의 발현에 대한 정량적 분석은 MS 환자의 두 그룹(백질 변화가 있거나 없는 뇌 조직)에서 샘플이 이 바이러스의 발현 수준이 상당히 더 높다는 것을 보여주었습니다. 더욱이 그들은 손상된 조직이 더 높은 바이러스 발현과 상관관계가 있다는 것을 보여주었고, 이는 HHV-6 이론에 기여하는 사실이 다발성 경화증의 병인에 연루되어 있다는 사실입니다.

바이러스에 대해 이러한 모든 방법을 사용하면 상충되는 결과가 관찰되었습니다. 실제로 사용된 기술이 HHV-6(혈액의 백혈구 분석, 뇌척수액 포함 세포 및 CNS 조직 분석)에 의한 활성 감염과 잠복 감염을 구별할 수 없을 때 샘플 환자와 컨트롤 그룹. 그러나 진단 기술이 HHV-6의 활성 검출을 위해 특별히 사용되는 경우 HHV-6과 MS의 병인 사이에 강한 상관관계가 관찰됩니다. 우리 그룹은 최근 HERV-W와 MOG의 외피 단백질 사이의 유사성 수준을 조사했습니다. 엔벨로프 MOG의 비교는 HERV-W의 아이디어를 확장하는 MOG 유사의 5개의 IgG 유사 도메인이 MS의 면역 병인 발생에 관여할 수 있으며 아마도 면역 시스템 MOG 레트로바이러스 영역에 의한 인식을 용이하게 하기 위해 관여할 수 있음을 확인했습니다. 우리는 또한 대부분의 환자가 일정 수준에서 HERV-W 엔벨로프의 발현을 보였다는 것을 보여주었습니다. 10개의 테스트 샘플 중 9개는 매우 낮은 발현 수준에 대해 중간에서 높은 수준의 HERV-W 엔벨로프 발현을 보였거나 건강한 대조군에서 활동이 없었으며, 이는 우리 모집단에서 MS 활동과 HERV-W 사이의 연관성을 확인했습니다.

이탈리아의 최근 연구에 따르면 EBV는 체외에서 혈액과 뇌의 세포에서 HERV-W의 발현을 자극합니다. 그들은 가능한 모델인 MS의 발병기전이 몇 년 후 MS의 초기 유발인자로 EBV를 포함할 수 있다고 제안하고 HERV-W가 MS의 병원성에 실제임을 보여주며, 완화 형태의 질병 행동과 유사하게 나타납니다. 신청인 기여자.

목표:

주요 목표: MS 환자의 혈액에서 HERV-W 및 Herpesviridae 계열의 바이러스에 대한 정량적 평가와 MS 활동의 임상 및 이미징을 연관시킵니다.

보조 목표:

HERV-W 및 헤르페스바이러스의 발현을 평가하고 다발성 경화증 환자와 다른 신경 질환이 있거나 없는 건강한 대조군 사이에서 바이러스 발현을 비교합니다.

중요성:

다발성 경화증은 유전적 및 환경적 병인이 있는 다인성 질병입니다. 인과 관계를 확립하기 위해 관련 요인에 대한 연구자의 관심이 큽니다. 여러 바이러스가 병인 및 질병 활동과 관련이 있습니다. 헤르페스 바이러스 및 HERV-W 바이러스가 MS의 활성과 인과 관계를 확립하려는 시도에서 가장 중요하지만, 지금까지 질병의 병인 및 발달에서 이러한 바이러스의 역할에 대해 열려 있는 많은 질문이 있습니다.

가설:

이 연구를 통해 MS와 관련된 병인 및 염증 활동에 대한 더 많은 가능한 답을 찾을 수 있을 것으로 기대되며, 따라서 이 병리학에 대한 점점 더 구체적이고 효과적인 치료법의 공식화에 도움이 될 더 일관된 데이터를 제공할 것입니다.

행동 양식:

처음에는 상용 키트를 사용하여 참여자의 혈청에서 IgG 및 면역글로불린 M(IgM) 항-EBV 및 CMV 항체를 검출하기 위해 모든 샘플을 ELISA 면역분석법으로 분석합니다.

제조업체의 지침에 따라 핵산 추출(DNA 및 RNA)을 수행합니다. 샘플에서 RNA의 순도와 DNA의 부재를 보장하기 위한 모든 프로토콜은 발현 분석(따라서 전사체 검출)에 채택됩니다. 따라서, 핵산은 DNAse로 처리되고 RT-PCR HERV-W에 의해 검증된다. RNA를 포함하는 샘플만 전사되고 추가 분석 대상이 됩니다. HERV-W의 RNA 정량화는 HERV-W 계열의 MSRV 아형에 특이적인 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 단핵 세포(PBMC)에서 이루어질 것입니다.

헤르페스 바이러스 DNA의 검출은 초기에 두 세트의 프라이머(HSVPAN 및 VZVPAN)를 사용하여 PCR에 의해 이루어집니다. 증폭 후 인간 헤르페스바이러스 6(6A 및 6B)을 포함하는 8가지 유형의 헤르페스바이러스를 타이핑하기 위해 BamHI 및 BstUI로 효소 소화를 수행한다. 양성으로 판명된 샘플의 경우 특정 바이러스에 대해 qRT-PCR이 수행됩니다.

설계:

생물학적 물질을 수집하고 대조군의 존재에 대한 전향적이고 종단적인 연구가 진행될 것입니다. 이 프로젝트는 정보에 입각한 무료 동의 기간을 통해 개인이 분석합니다. 동의서에 서명해야만 환자가 이 설문 조사에 참여할 수 있습니다.

신경과 외래 환자 클리닉(CATEM 및 기타 전문 분야)의 환자 혈액 샘플은 자격을 갖춘 전문가가 일상적인 방문 중에 수행합니다. 혈액 은행에서 환자의 혈액은 일상적으로 수행되는 검사와 함께 수집됩니다. 수집된 모든 자료는 실험실 테스트가 수행되는 상파울루 대학교 열대 의학 연구소의 바이러스 실험실로 보내집니다.

환자는 Freedman 등이 제안한 기준에 따라 MILD, MODERATE 및 SEVERE로 분류된 질병 활동과 MRI에서 연간 재발률, EDSS 등급 증가 및 두개골 병변 증가를 분석하여 임상 및 영상 질병 활동 정도에 대해 평가됩니다. 두개골 MRI는 MS 및 기타 신경계 질환이 있는 그룹에 대해서만 수행됩니다.

통계적 방법:

실험실 테스트 결과 후 데이터를 분석하고 파라메트릭 및 비모수 도구를 사용하여 통계적 해석 및 질병 활동과의 비교를 위해 필요한 치료를 받습니다. Student-t 및 Mann-Whitney 테스트는 임상, 인구 통계 및 실험실 매개 변수 간의 연관성을 평가하는 데 사용됩니다. 귀무가설을 기각하기 위한 알파 = 0.05 또는 5%의 유의 수준이 고정됩니다.

샘플 크기 계산:

샘플 크기는 PBMC에서 HERV-W의 검출 가능한 발현을 나타내는 MS가 있거나 없는 모집단의 백분율을 기준으로 결정되었습니다. 활성 레트로바이러스 엔벨로프를 나타내는 MS 환자의 수가 95%에 가깝지만 샘플 계산을 위해 보다 보수적인 값을 가정합니다. 따라서 케이스와 컨트롤에 대해 각각 50%와 10%의 표현을 가정하면 Kelsey 방법에 따라 신뢰 수준 = 95% 검출력을 기준으로 28개의 케이스와 28개의 컨트롤의 샘플 크기가 필요합니다. 따라서 조사관이 세 그룹(MS 포함, MS 및 기타 신경계 질환 없음)을 분석하므로 총 N은 그룹당 28명, 84명의 대상자입니다.