Jämförelse mellan klinisk och MRI multipel sklerosaktivitet och uttryck av humant endogent retrovirus typ W och herpesvirus

Bakgrund/motiv:

Multipel skleros (MS) är en inflammatorisk demyeliniserande sjukdom som påverkar ryggmärgen (särskilt i bakmärgen). Den kliniska heterogeniteten av MS är väl beskriven, men för närvarande är det känt att lesioner av MS och mekanismer som ligger bakom den patologiska förstörelsen av det centrala nervsystemet (CNS) också är heterogena. Det är en multifaktoriell sjukdom där en immunopatogen mekanism föreslås vara ansvarig för förstörelsen av höljesmyelinet.

Patologin för inflammatoriska ledskador av MS tyder dock på att specifika autoimmuna svar mot komponenter i CNS-myelin kan ha en avgörande roll i destruktionen av myelin. Detta koncept stöds av den höga nivån av oligoklonalt immunglobulin G (IgG) i cerebrospinalvätskan genom koppling till platsen för det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC), expansion av B- och T-celler som är reaktiva mot myelin i MS-lesioner och det faktum att immunisering med myelinproteiner inducerar en MS-liknande sjukdom hos djur, experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE).

Autoreaktiviteten för olika myelinproteiner, inklusive myelinbasprotein, proteolipidprotein och myelinassocierat glykoprotein i myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG), har observerats hos patienter med MS.

Det noteras dock att T-celler från patienter med MS visar en övervägande aktivitet mot MOG i förhållande till andra myelinproteiner, och anti-MOG-antikroppar identifierades kopplade till myelins sönderfall runt axoner i akuta lesioner av MS. Dessutom reproducerar sensibilisering med MOG den kliniska och demyeliniserande degenerativa patologin hos MS i gnagarmodeller och primater.

En infektiös etiologi för MS har också postulerats, och under flera år har ett antal olika virus föreslagits att utlösa immunopatologi. Ökade titlar av antikroppar upptäcktes för EBV, varicella zoster-virus och röda hundvirus, medan specifika proteiner humana endogena retrovirus (HERV), särskilt från HERV-W-familjen, upptäcktes i blodet och hjärnskador hos patienter med MS.

HERV uppstod från uråldriga infektioner av värdceller i könslinjen av exogena retrovirus och utgör idag cirka 8 % av det mänskliga genomet.

Retrovirus multipel skleros-associerad (MRSV), är ett höljevirus med omvänd transkriptasaktivitet, som representerar prototypen av HERV-W-familjens mänskliga genom.

MRSV isolerades i leptomeninges, i choroid plexus och i kulturer av monocyter/makrofager från MS-patienter och deras ursprung är fortfarande under utredning. Har föreslagits att partiklar härstammar från MSRV provirus HERV-W modifierat, eller överförs från en medlem av samma exogena familj. MSRV-virioner har egenskaper som superantigener, de inducerar produktionen av cytokiner av mononukleära celler i perifert humant blod.

HERV-partiklar associerade med omvänd transkriptasaktivitet (RT) bekräftades vara ett kännetecken för uttryck från MSRV. Ett protokoll för detektion av MSRV-virion med RT PCR utformades för att detektera deras närvaro i serum och cerebrospinalvätska (CSF) hos patienten.

Oberoende studier på patienter med MS och kontrollpopulationer visade korrelationer mellan MS och MSRV och dess prognos, inklusive omvandlingen av skov-remitterande MS i dess sekundära progressiva form (SP-MS).

Parallella studier visade immunopatogenesen av MSRV-virioner och identifierade höljeproteinet (Env) av MSRV som ansvarigt för det pro-inflammatoriska och superantigenicitetsimmuna. Env-antigenet upptäcktes på MS-patienter i studier av hjärnans obduktion.

Transaktiveringen av HERV-W-promotorerna av miljövirus associerat med MS har också visat sig inducera en epigenetisk dysreglering i HERV-W, när den finns i värdgenomet.

Det absolut viktigaste herpesviruset i samband med MS är EBV, förhållandet mellan EBV-serologi och utvecklingen av MS har studerats omfattande. Dessutom är interaktionen mellan EBV och immunsystemet obestridlig, vilket leder till ett ihållande immunsvar och immortalisering av lymfocyter. Det finns också studier som korrelerar uttrycket av EBV med större aktivitet av MS. Slutligen är interaktionen mellan EBV och endogena retrovirus ett nytt och fascinerande studieområde.

EBV var den första medlemmen i Herpesviridae-familjen som var inblandad som en potentiell orsak till MS 1971. EBV är en möjlig kandidat på grund av flera faktorer: den är utbredd i naturen, kräver en lång vilande virusinfektion som har kontinuerlig produktion på grund av perioder av reaktivering och modulerar det mänskliga immunsystemet.

Svårigheten att associera MS för att bevisa att EBV är virusinfektionen inträffade före uppkomsten av autoimmun sjukdom. Pohl et al. visade att EBV-seropositiviteten hos patienter med MS i Europa (barn) - var 99% högre jämfört med kontrollgruppen, vilka virusantikroppar hittades hos 72%.

Levin et al. uppskattade tiden för virusinfektion med serumantikroppstitrar före MS och jämförde med en kontrollgrupp. Denna studie hade tillgång till medicinska journaler för cirka 8 miljoner anställda i den amerikanska armén som hade lagrat blodprover. Av denna grupp parades fall-kontrollstudien där 305 personer kom för att senare utveckla MS och 610 utvalda kontrollpersoner; 10 fall som utvecklade MS och 32 kontroller var initialt EBV-seronegativa. Alla fall hade blivit positiva EBV före MS, jämfört med endast 35,7 % av kontrollerna som serokonverterade.

Andra studier har också försökt bedöma sambandet mellan antikroppstitrar mot EBV och uppkomsten av MS. Enligt De Lorenze et al.s arbete hade patienter med MS en signifikant ökning av antikroppar 20 år innan de första symtomen på MS. Detta faktum kan förklaras på två sätt: förekomsten av en tidigare infektion som förändrar balansen hos EBV-receptorcellerna (minnes-T-celler) eller återinfektion med en annan stam av EBV.

EBV infekterar B-lymfocyter och är ihållande mycket immunogena. De antigenspecifika cytotoxiska T-lymfocyterna produceras kontinuerligt och ökar i antal som svar på primär infektion och hög viremi. Denna immunkontroll är väsentlig för att förhindra EBV-relaterade maligniteter. I sin modulerande verkan lyckas den rädda infekterade B-lymfocyter via uttryck av latenta antigener och hjälper dem att differentiera till minnes-B-celler, där viruset kvarstår. Det är emellertid inte fastställt om de ökade T-cellerna specifika för EBV är ett svar på ökad stimulering genom specifik igenkänning av myelinantigener. EBV-virusmängden är inte särskilt hög i MS, dessutom verkar T-celler specifika för detta virus inte särskiljas från samma celler i värdar utan MS.

En annan utredare konstaterar att under perioder av MS-reaktivering finns en ökad aktivitet av virusreplikation i förhållande till perioder av remission. Patienter med antikroppssvar mot tidigt antigen av EBV är mer benägna att visa sjukdomsaktivitet mätt med MRT med gadolinium jämfört med patienter utan humoral respons. Dessa data fick oss att tro att sjukdomens aktivitet kan vara relaterad till latent EBV-infektion såväl som sjukdomsprogression.

Studier som korrelerar nivåer av antikroppar mot cytomegalovirus (CMV) och MS är kontroversiella. Även om de flesta av resultaten visar höga frekvenser av CMV-infektion hos patienter med MS, observeras å andra sidan en mildare presentation av sjukdomen.

Vissa utredare letade efter förekomsten av anti-CMV-antikroppar hos MS och friska individer. De fann positivt hos 98 % av MS-patienterna jämfört med 52 % i kontrollgruppen.

En annan utredare visade att patienter som hade antikroppar mot CMV var: senare ålder för sjukdomsdebut, lägre frekvens av reaktivering av sjukdomen och färre tecken på cerebral atrofi på MRT. De som hade högre titrar av dessa antikroppar hade mindre hjärnatrofi och färre lesioner vid bildbehandlingstester, jämfört med patienter som hade lägre titer. En djurmodell med imitation av MS-mönstren visade att djur med CMV-infektioner demyeliniserande ram före kliniska presentationer var svagare än de som inte var infekterade. Dessa studier tyder på en fördelaktig modulerande effekt av CMV-infektion på immunsvaret vid MS.

Herpesviruset (HHV-6 och HHV-7) är nära besläktade och har ett liknande biologiskt mönster. Dessa virus kan infektera celler i immunsystemet och modulera deras funktioner. Det arbete som beskrivs av Krukle-Nora et al. försökte undersöka samband mellan HHV-6 och HHV-7 i MS genom att analysera patienters perifera blod. Patienterna valdes slumpmässigt ut och delades in i 02 grupper: 14 patienter med skovvis förlöpande MS (RR-MS) och 14 med sekundär progressiv MS (SP-MS). Alla studiepatienter var minst 3 månader utan användning av immunsuppressiva läkemedel. Av de 28 patienterna hade 25 latent HHV-6-infektion och/eller HHV-7. HHV-6 har hittats hos 9 patienter med RR-MS och 9 med SP-MS. HHV-7 hittades hos 10 patienter med RR-MS och 14 med SP-MS.

Två utredare som använder tekniken för fluorescerande in situ hybridisering, undersökte mänskliga kadaveriska vävnader för att utvärdera uttrycket av tidiga och sena virala gener vid vit substans i den drabbade vävnaden hos patienter med MS och i hjärnprover utan sjukdom. Genen av HHV-6 hittades i alla prover och var begränsad till oligodendrocyter. Kvantitativ analys av uttrycket av viralt RNA visade att i båda grupperna av MS-patienter (hjärnvävnad med och utan förändring av vit substans) hade prover signifikant högre nivåer av uttryck av detta virus. Dessutom visade de att de skadade vävnaderna var korrelerade med högre viralt uttryck, ett faktum som bidrar till teorin om HHV-6 är inblandad i patogenesen av MS.

Genom att använda alla dessa metoder för virus observerades motstridiga resultat. Faktum är att när de använda teknologierna inte kunde särskilja aktiv från latent infektion av HHV-6 (genom analys av leukocyter från blodet, av cerebrospinalvätska innehållande celler och vävnad i CNS), hittas ingen skillnad bland provpatienterna och kontrollgruppen. Men när diagnostiska teknologier används specifikt för att detektera aktivitet av HHV-6, observeras en stark korrelation mellan HHV-6 och patogenesen av MS. Vår grupp har nyligen undersökt nivån av likhet mellan höljesproteinet hos HERV-W och MOG. En jämförelse av höljet MOG identifierade fem IgG-liknande domäner av MOG-liknande som utökar idén om HERV-W kan vara involverad i immunopatogenesen av MS, kanske för att underlätta igenkänning av immunsystemets MOG retrovirala regioner. Vi har också visat att de flesta patienter visade uttryck av HERV-W-höljet på någon nivå. Nio av de tio testade proverna hade medelhöga till höga nivåer av HERV-W-höljeuttryck mot mycket låga uttrycksnivåer eller ingen aktivitet hos friska kontroller, vilket bekräftar sambandet mellan MS-aktivitet och HERV-W i vår population.

En nyligen genomförd studie i Italien visade att EBV stimulerar uttrycket av HERV-W i celler från blod och hjärna in vitro. De föreslår att patogenesen av MS, en möjlig modell skulle kunna inkludera EBV som den första utlösaren av MS, år senare, och visar HERV-W som verklig för patogeniciteten av MS, i slående parallell med sjukdomens beteende i deras remitterande form bidragsgivare klaganden.

Mål:

Primärt mål: korrelera klinisk och avbildning av MS-aktivitet med kvantitativ bedömning av HERV-W och virus från familjen Herpesviridae i blodet hos patienter med MS.

Sekundärt mål:

Bedöm uttrycket av HERV-W och Herpesvirus och jämför virusuttrycket bland patienter med MS och friska kontroller med och utan andra neurologiska sjukdomar.

Betydelse:

MS är en multifaktoriell sjukdom, med genetisk och miljömässig etiologi. Det är stort intresse forskarna för associerade faktorer att fastställa ett orsakssamband. Flera virus har kopplats till patogenes och sjukdomsaktivitet. Även om herpesvirus och HERV-W-virus är de viktigaste i försöket att etablera ett orsakssamband och med aktiviteten av MS, finns det fram till nu många frågor som förblir öppna om dessa viruss roll i sjukdomens etiologi och utveckling.

Hypotes:

Med detta arbete förväntas det hitta fler möjliga svar på etiopatogenes och inflammatorisk aktivitet relaterad till MS, och på så sätt tillhandahålla mer konsekventa data som kommer att hjälpa utformningen av allt mer specifika och effektiva terapier riktade mot denna patologi.

Metoder:

Inledningsvis kommer alla prover att analyseras med ELISA-immunanalys för detektering av IgG och immunglobulin M (IgM) anti-EBV- och CMV-antikroppar i deltagarnas serum, med hjälp av kommersiella kit.

Nukleinsyraextraktionen kommer att utföras (DNA och RNA), enligt tillverkarens instruktioner. Alla protokoll för att säkerställa renheten av RNA och frånvaron av DNA i proverna kommer att antas i analysen av uttryck (och därmed detektion av transkript). Sålunda utsätts nukleinsyrorna för behandling med DNAs och verifiering med RT-PCR HERV-W. Endast prover som innehåller RNA kommer att transkriberas och utsättas för ytterligare analys. RNA-kvantifiering av HERV-W kommer att göras på mononukleära celler (PBMC) genom en kvantitativ polymeraskedjereaktion (qRT-PCR) specifik för subtypen MSRV av HERV-W-familjen.

Detekteringen av herpesvirus-DNA kommer initialt att göras med en PCR, med användning av två uppsättningar primrar (HSVPAN och VZVPAN). Efter amplifiering utförs en enzymatisk digestion med BamHI och BstUI för typning av herpesviruset åtta typer inklusive humant herpesvirus 6 (6A och 6B). För prover som visar sig vara positiva kommer en qRT-PCR att hållas för specifika virus.

Design:

En prospektiv, longitudinell studie som samlat in biologiskt material och närvaron av en kontrollgrupp kommer att hållas. Detta projekt kommer att analyseras av individerna, genom termen av fritt och informerat samtycke. Endast genom att underteckna samtyckesformuläret kommer patienten att kunna delta i denna undersökning.

Blodprover från patienter från neurologiska polikliniken (CATEM och andra specialiteter) kommer att tas under rutinbesök av en kvalificerad specialist. Patienternas blod från Blodbanken kommer att samlas in i samband med den rutinmässiga undersökningen. Allt material som samlas in kommer att skickas till virologilaboratoriet vid Institutet för tropisk medicin, University of São Paulo, där laboratorietester utförs.

Patienter kommer att bedömas för graden av klinisk och avbildande sjukdomsaktivitet genom att analysera den årliga återfallsfrekvensen, ökningar av EDSS-skalan och ökade kraniella lesioner på MRT och sjukdomsaktivitet som klassificeras som MILDA, MÅTTLIGA och ALVARLIGA enligt de föreslagna kriterierna av Freedman et al. Kranial MRT kommer endast att utföras för grupper med MS och med andra neurologiska sjukdomar.

Statistiska metoder:

Efter laboratorietestresultat kommer data att analyseras och få nödvändig behandling för sin statistiska tolkning och jämförelse med sjukdomsaktiviteten med hjälp av parametriska och icke-parametriska verktyg. Student-t- och Mann-Whitney-testen kommer att användas för att utvärdera samband mellan kliniska, demografiska och laboratorieparametrar. Signifikansnivån för alfa = 0,05 eller 5 % för att förkasta nollhypotesen kommer att fastställas.

Beräkning av provstorlek:

Provstorleken bestämdes baserat på procentandelen av populationen med och utan MS som visar påvisbart uttryck av HERV-W i PBMC. Även om antalet patienter med MS som uppvisar aktivitetsretrovirushölje är nära 95%, antar vi mer konservativa värden för provberäkningen. Därför, om man antar uttryck med 50 % och 10 % för fall respektive kontroller, är en urvalsstorlek på 28 fall och 28 kontroller nödvändig, baserat på en konfidensnivå = 95 % kraft för att detektera 80 %, enligt Kelsey-metoden. Eftersom utredarna kommer att analysera tre grupper (med MS, utan MS och andra neurologiska sjukdomar) är det totala antalet 84 försökspersoner, 28 per grupp.