Srovnání mezi klinickou a MRI aktivitou roztroušené sklerózy a expresí lidského endogenního retroviru typu W a herpesviru

Pozadí/důvod:

Roztroušená skleróza (RS) je zánětlivé demyelinizační onemocnění, které postihuje míchu (zejména zadní provazce). Klinická heterogenita RS je dobře popsána, ale v současné době je známo, že léze RS a mechanismy, které se podílejí na patologické destrukci centrálního nervového systému (CNS), jsou také heterogenní. Jde o multifaktoriální onemocnění, u kterého se předpokládá, že jeden imunopatogenní mechanismus je zodpovědný za destrukci myelinu pochvy.

Patologie zánětlivých kloubních lézí RS však naznačuje, že specifické autoimunitní reakce proti složkám myelinu CNS mohou mít zásadní roli při destrukci myelinu. Tento koncept je podpořen vysokou hladinou oligoklonálního imunoglobulinu G (IgG) v mozkomíšním moku spojením s lokusem hlavního histokompatibilního komplexu (MHC), expanzí B a T buněk reaktivních na myelin v lézích MS a skutečností, že imunizace myelinové proteiny indukují onemocnění podobné RS u zvířat, experimentální autoimunitní encefalomyelitidu (EAE).

U pacientů s RS byla pozorována autoreaktivita pro různé myelinové proteiny, včetně myelinového bazického proteinu, proteolipidového proteinu a myelin-asociovaného glykoproteinu v myelinovém oligodendrocytovém glykoproteinu (MOG).

Je však třeba poznamenat, že T buňky pacientů s RS vykazují převažující aktivitu proti MOG ve vztahu k jiným myelinovým proteinům a anti-MOG protilátky byly identifikovány spojené s dezintegrací myelinu kolem axonů v akutních lézích RS. Kromě toho senzitizace MOG reprodukuje klinickou a demyelinizační degenerativní patologii RS u modelů hlodavců a primátů.

Také se předpokládá infekční etiologie RS a během několika let bylo navrženo, aby spouštěly imunopatologii řada různých virů. Byly detekovány zvýšené názvy protilátek pro EBV, virus varicella zoster a virus zarděnek, zatímco specifické proteiny lidských endogenních retrovirů (HERV), zejména z rodiny HERV-W, byly detekovány v krevních a mozkových lézích u pacientů s RS.

HERV vznikl z dávných infekcí hostitelských buněk zárodečné linie exogenními retroviry a dnes tvoří asi 8 % lidského genomu.

Retrovirus spojený s roztroušenou sklerózou (MRSV) je obalený virus s aktivitou reverzní transkriptázy, který představuje prototyp lidského genomu rodiny HERV-W.

MRSV byl izolován v leptomeningech, v choroidálním plexu a v kulturách monocytů/makrofágů pacientů s RS a jejich původ je stále zkoumán. Bylo navrženo, že částice pocházejí z MSRV proviru HERV-W modifikovaného nebo přenášeného členem stejné exogenní rodiny. MSRV viriony mají vlastnosti jako superantigeny, indukují produkci cytokinů mononukleárními buňkami v periferní lidské krvi.

Bylo potvrzeno, že částice HERV spojené s aktivitou reverzní transkriptázy (RT) jsou charakteristickým znakem exprese z MSRV. Protokol pro detekci virionů MSRV pomocí RT PCR byl navržen tak, aby detekoval jejich přítomnost v séru a mozkomíšním moku (CSF) pacienta.

Nezávislé studie na pacientech s RS a kontrolní populaci ukázaly korelace mezi RS a MSRV a její prognózou, včetně konverze relabující-remitující RS v její sekundární progresivní formu (SP-MS).

Paralelní studie ukázaly imunopatogenezi virionů MSRV a identifikovaly obalový protein (Env) MSRV jako odpovědný za prozánětlivou a superantigenní imunitu. Env antigen byl detekován u pacientů s RS ve studiích mozkových postmortem.

Bylo také ukázáno, že trans-aktivace promotorů HERV-W environmentálním virem spojeným s RS vyvolává epigenetickou dysregulaci v HERV-W, pokud je přítomen v hostitelském genomu.

Nejdůležitějším herpesvirem spojeným s RS je určitě EBV, poměr mezi sérologií EBV a rozvojem RS byl rozsáhle studován. Dále je nepopiratelné, že interakce mezi EBV a imunitním systémem vede k trvalé imunitní odpovědi a imortalizaci lymfocytů. Existují také studie, které korelují expresi EBV s větší aktivitou RS. A konečně, interakce mezi EBV a endogenními retroviry jsou nedávnou a fascinující oblastí studia.

EBV byl prvním členem čeledi Herpesviridae, který byl v roce 1971 implikován jako potenciální příčina RS. EBV je možným kandidátem kvůli několika faktorům: je v přírodě rozšířený, vyžaduje dlouhou klidovou virovou infekci, která má nepřetržitou produkci v důsledku období reaktivace a moduluje lidský imunitní systém.

Obtížnost přiřadit RS k prokázání, že EBV je virová infekce, se objevila před nástupem autoimunitního onemocnění. Pohl a kol. ukázaly, že EBV-séropozitivita u pacientů s RS v Evropě (děti) - byla o 99 % vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou, kde byly protilátky proti viru nalezeny u 72 %.

Levin a kol. odhadli dobu virové infekce titry sérových protilátek před MS a porovnali s kontrolní skupinou. Tato studie měla přístup k lékařským záznamům přibližně 8 milionů zaměstnanců americké armády, kteří uchovávali vzorky krve. Z této skupiny byla spárována případová-kontrolní studie, kde 305 lidí přišlo k pozdějšímu rozvoji RS a 610 vybraných kontrolních subjektů bylo spárováno; 10 případů, u kterých se rozvinula RS, a 32 kontrol bylo zpočátku EBV séronegativní. Všechny případy se staly pozitivními na EBV před MS, ve srovnání s pouze 35,7 % kontrol, které prodělaly sérokonverzi.

Jiné studie se také pokusily posoudit vztah mezi titry protilátek proti EBV a nástupem RS. Podle práce De Lorenze et al., měli pacienti s RS významný nárůst protilátek 20 let před prvními příznaky RS. Tuto skutečnost lze vysvětlit dvěma způsoby: existencí předchozí infekce měnící rovnováhu EBV receptorových buněk (paměťové T buňky) nebo reinfekcí jiným kmenem EBV.

EBV infikuje B lymfocyty a je trvale vysoce imunogenní. Antigenně specifické cytotoxické T lymfocyty jsou produkovány nepřetržitě a jejich počet se zvyšuje v reakci na primární infekci a vysokou virémii. Tato imunitní kontrola je nezbytná pro prevenci malignit souvisejících s EBV. Ve svém modulačním působení zvládá zachraňovat infikované B lymfocyty prostřednictvím exprese latentních antigenů a pomáhá jim diferencovat se na paměťové B lymfocyty, kde virus přetrvává. Není však stanoveno, zda zvýšený počet T buněk specifických pro EBV je odpovědí na zvýšenou stimulaci specifickým rozpoznáním myelinových antigenů. Virová zátěž EBV není u RS příliš vysoká, navíc se nezdá, že by T buňky specifické pro tento virus byly odlišeny od stejných buněk u hostitelů bez MS.

Jiný výzkumník uvádí, že během období reaktivace RS dochází ke zvýšené aktivitě replikace viru ve vztahu k obdobím remise. U pacientů s protilátkovou odpovědí na časný antigen EBV je pravděpodobnější, že budou vykazovat aktivitu onemocnění měřenou pomocí MRI s gadoliniem, ve srovnání s pacienty bez humorální odpovědi. Tyto údaje nás vedly k domněnce, že aktivita onemocnění může souviset s latentní infekcí EBV i s progresí onemocnění.

Studie korelující hladiny protilátek proti cytomegaloviru (CMV) a RS jsou kontroverzní. Ačkoli většina výsledků ukazuje vysokou míru CMV infekce u pacientů s RS, na druhou stranu je pozorován mírnější projev onemocnění.

Někteří výzkumníci hledali přítomnost anti-CMV protilátek u RS a zdravých jedinců. Pozitivní byly u 98 % pacientů s RS ve srovnání s 52 % v kontrolní skupině.

Další výzkumníci ukázali, že pacienti, kteří měli protilátky proti CMV, byli: pozdější věk nástupu onemocnění, nižší míra reaktivace onemocnění a méně příznaků cerebrální atrofie na MRI. Ti, kteří měli vyšší titry těchto protilátek, měli menší atrofii mozku a méně lézí při zobrazovacích testech ve srovnání s pacienty, kteří měli titry nižší. Zvířecí model s napodobujícími vzory RS prokázal, že zvířata s demyelinizačním rámcem CMV infekcí před klinickými projevy byla slabší než zvířata neinfikovaná. Tyto studie naznačují prospěšný modulační účinek CMV infekce na imunitní odpověď u RS.

Herpesvirus (HHV-6 a HHV-7) jsou blízce příbuzné a mají podobný biologický vzorec. Tyto viry jsou schopny infikovat buňky imunitního systému a modulovat jejich funkce. Práce popsaná Krukle-Nora et al. se pokusili prozkoumat souvislosti mezi HHV-6 a HHV-7 u RS analýzou periferní krve pacientů. Pacienti byli náhodně vybráni a rozděleni do 02 skupin: 14 pacientů s relabující-remitující RS (RR-MS) a 14 se sekundárně progresivní RS (SP-MS). Všichni pacienti ve studii byli nejméně 3 měsíce bez užívání imunosupresiv. Z 28 pacientů mělo 25 latentní infekci HHV-6 a/nebo HHV-7. HHV-6 byl nalezen u 9 pacientů s RR-MS a 9 s SP-MS. HHV-7 byly nalezeny u 10 pacientů s RR-MS a 14 s SP-MS.

Dva výzkumníci pomocí techniky fluorescenční hybridizace in situ zkoumali lidské kadaverózní tkáně za účelem vyhodnocení exprese časných a pozdních virových genů v bílé hmotě v postižené tkáni pacientů s RS a ve vzorcích mozku bez onemocnění. Gen HHV-6 byl nalezen ve všech vzorcích a byl omezen na oligodendrocyty. Kvantitativní analýza exprese virové RNA ukázala, že u obou skupin pacientů s RS (mozková tkáň se změnou bílé hmoty a bez ní) měly vzorky významně vyšší hladiny exprese tohoto viru. Dále ukázali, že poškozené tkáně korelovaly s vyšší virovou expresí, což je skutečnost, která přispívá k teorii HHV-6, která se podílí na patogenezi RS.

Při použití všech těchto metod pro virus byly pozorovány protichůdné výsledky. Ve skutečnosti, když použité technologie nebyly schopny odlišit aktivní od latentní infekce HHV-6 (analýzou leukocytů z krve, buněk obsahujících mozkomíšní mok a tkáně CNS), nebyl nalezen žádný rozdíl mezi pacienty ze vzorků a kontrolní skupina. Když se však diagnostické technologie používají specificky pro detekci aktivity HHV-6, je pozorována silná korelace mezi HHV-6 a patogenezí RS. Naše skupina nedávno zkoumala úroveň podobnosti mezi obalovým proteinem HERV-W a MOG. Porovnání obálky MOG identifikovalo pět domén podobných IgG nebo podobných MOG, které rozšiřují myšlenku HERV-W, se mohou podílet na imunopatogenezi RS, možná pro usnadnění rozpoznání retrovirových oblastí MOG imunitním systémem. Také jsme ukázali, že většina pacientů vykazovala expresi obálky HERV-W na určité úrovni. Devět z deseti testovaných vzorků mělo střední až vysoké hladiny exprese obálky HERV-W oproti velmi nízkým hladinám exprese nebo žádnou aktivitu u zdravých kontrol, což potvrzuje souvislost mezi aktivitou MS a HERV-W v naší populaci.

Nedávná studie v Itálii ukázala, že EBV stimuluje expresi HERV-W v buňkách z krve a mozku in vitro. Naznačují, že patogeneze RS, možný model by mohl zahrnovat EBV jako počáteční spouštěč RS, o roky později, a ukazuje HERV-W jako skutečnou patogenitu RS, nápadně paralelně s chováním choroby v její remitující formě. přispěvatel navrhovatel.

Cíle:

Primární cíl: korelovat klinickou a zobrazovací aktivitu RS s kvantitativním hodnocením HERV-W a virů z čeledi Herpesviridae v krvi pacientů s RS.

Sekundární cíl:

Vyhodnoťte expresi HERV-W a Herpesviru a porovnejte expresi virů u pacientů s RS a zdravých kontrol s jinými neurologickými onemocněními a bez nich.

Význam:

RS je multifaktoriální onemocnění s genetickou a environmentální etiologií. Je velký zájem výzkumníků o přidružené faktory, aby vytvořili kauzální vztah. Několik virů bylo spojeno s patogenezí a aktivitou onemocnění. Přestože herpesvirus a viry HERV-W jsou nejdůležitější při pokusu o stanovení kauzálního vztahu as aktivitou RS, dosud existuje mnoho otevřených otázek o roli těchto virů v etiologii a rozvoji onemocnění.

Hypotéza:

Očekává se, že díky této práci najdeme více možných odpovědí na etiopatogenezi a zánětlivou aktivitu související s RS, a tím poskytneme konzistentnější údaje, které pomohou formulovat stále specifičtější a účinnější terapie zaměřené na tuto patologii.

Metody:

Nejprve budou všechny vzorky analyzovány imunotestem ELISA pro detekci IgG a imunoglobulinových M (IgM) anti-EBV a CMV protilátek v séru účastníků za použití komerčních kitů.

Extrakce nukleové kyseliny bude provedena (DNA a RNA) podle pokynů výrobce. Při analýze exprese (a tedy detekce transkriptů) budou přijaty všechny protokoly pro zajištění čistoty RNA a nepřítomnosti DNA ve vzorcích. Nukleové kyseliny jsou tedy podrobeny ošetření DNAázou a ověření pomocí RT-PCR HERV-W. Pouze vzorky obsahující RNA budou transkribovány a podrobeny další analýze. Kvantifikace RNA HERV-W bude provedena na mononukleárních buňkách (PBMC) pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qRT-PCR) specifické pro podtyp MSRV rodiny HERV-W.

Detekce DNA herpesviru bude zpočátku provedena pomocí PCR za použití dvou sad primerů (HSVPAN a VZVPAN). Po amplifikaci se provede enzymatické štěpení pomocí BamHI a BstUI pro typizaci osmi typů herpesviru včetně lidského herpesviru 6 (6A a 6B). U vzorků, které se ukáží jako pozitivní, bude provedena qRT-PCR pro konkrétní viry.

Design:

Bude provedena prospektivní, longitudinální studie, která odebírala biologický materiál a přítomnost kontrolní skupiny. Tento projekt bude jednotlivci analyzován prostřednictvím svobodného a informovaného souhlasu. Pouze podepsáním formuláře souhlasu se pacient bude moci zúčastnit tohoto průzkumu.

Odběry krve pacientům z neurologické ambulance (CATEM a další obory) budou prováděny při běžné návštěvě kvalifikovaným odborníkem. Krev pacientů z Krevní banky bude odebírána společně s běžně prováděným vyšetřením. Všechny shromážděné materiály budou zaslány do virologické laboratoře Institutu tropické medicíny Univerzity v São Paulu, kde se provádějí laboratorní testy.

U pacientů bude hodnocen stupeň klinické a zobrazovací aktivity onemocnění analýzou ročního počtu recidiv, nárůstů na stupnici EDSS a zvýšených lebečních lézí na MRI a aktivity onemocnění klasifikované jako MILD, STŘEDNÍ a ZÁVAŽNÉ podle kritérií navržených Freedmanem et al. Kraniální MRI se bude provádět pouze u skupin s RS a s jinými neurologickými onemocněními.

Statistické metody:

Po výsledcích laboratorních testů budou data analyzována a získaná potřebná úprava pro jejich statistickou interpretaci a srovnání s aktivitou onemocnění pomocí parametrických a neparametrických nástrojů. Testy Student-t a Mann-Whitney budou použity k vyhodnocení souvislostí mezi klinickými, demografickými a laboratorními parametry. Hladina významnosti alfa = 0,05 nebo 5 % pro zamítnutí nulové hypotézy bude pevná.

Vzorový výpočet velikosti:

Velikost vzorku byla stanovena na základě procenta populace s a bez MS vykazující detekovatelnou expresi HERV-W v PBMC. Přestože se počet pacientů s RS, kteří vykazují aktivitu retrovirové obálky, blíží 95 %, předpokládáme konzervativnější hodnoty pro výpočet vzorku. Proto za předpokladu exprese 50 % a 10 % pro případy a 10 % pro případy a kontroly je nutný vzorek o velikosti 28 případů a 28 kontrol, na základě hladiny spolehlivosti = 95% síla k detekci 80 %, podle Kelseyho metody. Takže, protože výzkumníci budou analyzovat tři skupiny (s RS, bez RS a dalších neurologických onemocnění), celkový počet N je 84 subjektů, 28 na skupinu.