Comparação entre atividade de esclerose múltipla clínica e ressonância magnética e expressão de retrovírus humano endógeno tipo W e herpesvírus

Antecedentes/Justificativa:

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória desmielinizante que afeta a medula espinhal (especialmente nas medulas posteriores). A heterogeneidade clínica da EM está bem descrita, mas atualmente sabe-se que as lesões da EM e os mecanismos subjacentes envolvidos na destruição patológica do sistema nervoso central (SNC) também são heterogêneos. É uma doença multifatorial em que um mecanismo imunopatogênico é sugerido como responsável pela destruição da bainha de mielina.

No entanto, a patologia das lesões articulares inflamatórias da EM sugere que respostas autoimunes específicas contra componentes da mielina do SNC podem ter um papel crucial na destruição da mielina. Este conceito é apoiado pelo alto nível de imunoglobulina oligoclonal G (IgG) no líquido cefalorraquidiano por ligação com o locus do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), expansão de células B e T reativas à mielina em lesões de EM e o fato de que a imunização com as proteínas da mielina induzem uma doença semelhante à EM em animais, a encefalomielite autoimune experimental (EAE).

A autorreatividade para várias proteínas da mielina, incluindo proteína básica da mielina, proteína proteolipídica e glicoproteína associada à mielina na glicoproteína de oligodendrócitos da mielina (MOG), foi observada em pacientes com EM.

Nota-se, entretanto, que células T de pacientes com EM apresentam atividade predominante contra MOG em relação a outras proteínas da mielina, e anticorpos anti-MOG foram identificados ligados à desintegração da mielina ao redor dos axônios em lesões agudas de EM. Além disso, a sensibilização com MOG reproduz a patologia degenerativa clínica e desmielinizante da EM em modelos de roedores e primatas.

Uma etiologia infecciosa da EM também foi postulada e, ao longo de vários anos, vários vírus diferentes foram sugeridos para desencadear a imunopatologia. Títulos aumentados de anticorpos foram detectados, para EBV, vírus varicela zoster e vírus da rubéola, enquanto proteínas específicas retrovírus endógenos humanos (HERV), em particular da família HERV-W foram detectadas no sangue e lesões cerebrais em pacientes com EM.

O HERV surgiu de infecções antigas de células hospedeiras da linhagem germinativa por retrovírus exógenos e hoje constituem cerca de 8% do genoma humano.

O retrovírus associado à esclerose múltipla (MRSV), é um vírus envelopado com atividade de transcriptase reversa, que representa o protótipo do genoma humano da família HERV-W.

O MRSV foi isolado em leptomeninges, no plexo coróide e em culturas de monócitos/macrófagos de pacientes com EM e sua origem ainda está sob investigação. Tem sido sugerido que as partículas são originadas do provírus MSRV HERV-W modificado, ou transmitidas de um membro da mesma família exógena. Os virions MSRV possuem propriedades como superantígenos, eles induzem a produção de citocinas por células mononucleares no sangue periférico humano.

As partículas de HERV associadas à atividade da transcriptase reversa (RT) foram confirmadas como uma marca registrada da expressão de MSRV. Um protocolo para detecção de virion MSRV por RT PCR foi projetado para detectar sua presença no soro e líquido cefalorraquidiano (LCR) do paciente.

Estudos independentes em pacientes com EM e populações de controle mostraram correlações entre EM e MSRV e seu prognóstico, incluindo a conversão de EM remitente-recorrente em sua forma secundária progressiva (SP-MS).

Estudos paralelos mostraram a imunopatogênese dos vírions do MSRV e identificaram a proteína do envelope (Env) do MSRV como sendo responsável pela imunidade pró-inflamatória e superantigênica. O antígeno Env foi detectado em pacientes com EM em estudos de cérebro pós-morte.

A transativação dos promotores do HERV-W pelo vírus ambiental associado à EM também demonstrou induzir uma desregulação epigenética no HERV-W, quando presente no genoma do hospedeiro.

Certamente o vírus do herpes mais importante associado à EM é o EBV, a relação entre a sorologia do EBV e o desenvolvimento da EM tem sido extensivamente estudada. Além disso, a interação entre o EBV e o sistema imunológico é inegável, levando a uma resposta imune persistente e à imortalização dos linfócitos. Há também estudos que correlacionam a expressão do EBV com maior atividade do MS. Finalmente, a interação entre EBV e retrovírus endógenos é um campo de estudo recente e fascinante.

O EBV foi o primeiro membro da família Herpesviridae a ser implicado como uma causa potencial de EM em 1971. O EBV é um possível candidato devido a vários fatores: é de natureza disseminada, requer uma longa infecção viral quiescente que tem produção contínua devido a períodos de reativação e modula o sistema imunológico humano.

A dificuldade em associar a EM para provar que o EBV é a infecção pelo vírus ocorreu antes do surgimento da doença autoimune. Pohl et ai. mostraram que a soropositividade para EBV em pacientes com EM na Europa (crianças) - foi 99% maior quando comparada ao grupo controle, cujos anticorpos do vírus foram encontrados em 72%.

Levin e outros. estimou o tempo de infecção viral por títulos de anticorpos séricos antes da EM e comparou com um grupo controle. Este estudo teve acesso aos registros médicos de aproximadamente 8 milhões de funcionários do Exército dos EUA que armazenaram amostras de sangue. Deste grupo, o estudo de caso-controle onde 305 pessoas vieram a desenvolver MS posteriormente e 610 indivíduos de controle selecionados foram pareados; 10 casos que desenvolveram EM e 32 controles eram inicialmente soronegativos para EBV. Todos os casos tornaram-se positivos para EBV antes da EM, em comparação com apenas 35,7% dos controles que soroconverteram.

Outros estudos também tentaram avaliar a relação entre os títulos de anticorpos contra o EBV e o aparecimento da EM. De acordo com o trabalho de De Lorenze et al., os pacientes com EM tiveram um aumento significativo de anticorpos 20 anos antes dos primeiros sintomas de EM. Este fato pode ser explicado de duas formas: a existência de uma infecção prévia alterando o equilíbrio das células receptoras do EBV (células T de memória) ou a reinfecção com uma cepa diferente do EBV.

O EBV infecta linfócitos B e é persistentemente altamente imunogênico. Os linfócitos T citotóxicos específicos do antígeno são produzidos continuamente e aumentam em número em resposta à infecção primária e alta viremia. Esse controle imunológico é essencial para prevenir malignidades relacionadas ao EBV. Em sua ação moduladora, consegue resgatar os linfócitos B infectados via expressão de antígenos latentes e ajuda-os a se diferenciar em células B de memória, onde o vírus persiste. No entanto, não está estabelecido se o aumento de células T específicas para EBV é uma resposta ao aumento da estimulação por reconhecimento específico de antígenos de mielina. A carga viral do EBV não é muito elevada na EM, além disso, as células T específicas para este vírus não parecem ser diferenciadas das mesmas células em hospedeiros sem EM.

Outro investigador afirma que durante os períodos de reativação da EM há um aumento da atividade de replicação do vírus em relação aos períodos de remissão. Pacientes com resposta de anticorpos ao antígeno precoce do EBV têm maior probabilidade de apresentar atividade da doença medida por ressonância magnética com gadolínio, quando comparados a pacientes sem resposta humoral. Esses dados nos levam a crer que a atividade da doença pode estar relacionada à infecção latente por EBV, bem como à progressão da doença.

Estudos correlacionando níveis de anticorpos contra citomegalovírus (CMV) e EM são controversos. Embora a maioria dos resultados mostre altas taxas de infecção por CMV em pacientes com EM, por outro lado, observa-se uma apresentação mais branda da doença.

Alguns investigadores procuraram a presença de anticorpos anti-CMV na EM e em indivíduos saudáveis. Eles encontraram resultados positivos em 98% dos pacientes com EM, em comparação com 52% no grupo controle.

Outros investigadores mostraram que os pacientes que apresentavam anticorpos contra o CMV apresentavam: idade mais avançada de início da doença, taxas mais baixas de reativação da doença e menos sinais de atrofia cerebral na ressonância magnética. Aqueles que tiveram títulos mais altos desses anticorpos tiveram menos atrofia cerebral e menos lesões em exames de imagem, em comparação com pacientes que tiveram títulos mais baixos. Um modelo animal que mimetiza os padrões da EM demonstrou que animais com quadros desmielinizantes de infecções por CMV antes das apresentações clínicas eram mais fracos do que aqueles não infectados. Esses estudos sugerem um efeito modulador benéfico da infecção por CMV na resposta imune na EM.

Os herpesvírus (HHV-6 e HHV-7) estão intimamente relacionados e apresentam padrão biológico semelhante. Esses vírus são capazes de infectar células do sistema imunológico e modular suas funções. O trabalho descrito por Krukle-Nora et al. tentaram investigar associações entre HHV-6 e HHV-7 na EM por meio da análise do sangue periférico de pacientes. Os pacientes foram selecionados aleatoriamente e divididos em 02 grupos: 14 pacientes com EM remitente recorrente (EM-RR) e 14 com EM secundária progressiva (EM-SP). Todos os pacientes do estudo estavam há pelo menos 3 meses sem uso de drogas imunossupressoras. Dos 28 pacientes, 25 apresentavam infecção latente por HHV-6 e/ou HHV-7. HHV-6 foi encontrado em 9 pacientes com RR-MS e 9 com SP-MS. O HHV-7 foi encontrado em 10 pacientes com RR-MS e 14 com SP-MS.

Dois investigadores, usando a técnica de hibridização fluorescente in situ, examinaram tecidos de cadáveres humanos para avaliar a expressão de genes virais precoces e tardios na substância branca no tecido afetado de pacientes com EM e em amostras cerebrais sem doença. O gene do HHV-6 foi encontrado em todas as amostras e restrito aos oligodendrócitos. A análise quantitativa da expressão do RNA viral mostrou que em ambos os grupos de pacientes com EM (tecido cerebral com e sem alteração da substância branca) as amostras apresentaram níveis significativamente mais elevados de expressão desse vírus. Além disso, mostraram que os tecidos lesados ​​estavam correlacionados com maior expressão viral, fato que contribui para a teoria de que o HHV-6 está implicado na patogênese da EM.

Usando todos esses métodos para vírus, foram observados resultados conflitantes. De fato, quando as tecnologias utilizadas não foram capazes de distinguir a infecção ativa da latente pelo HHV-6 (por análise de leucócitos do sangue, de células contendo líquido cefalorraquidiano e de tecido do SNC), nenhuma diferença é encontrada entre as amostras de pacientes e o grupo de controle. No entanto, quando tecnologias de diagnóstico são usadas especificamente para detecção da atividade do HHV-6, observa-se uma forte correlação entre o HHV-6 e a patogênese da EM. Nosso grupo investigou recentemente o nível de similaridade entre a proteína do envelope de HERV-W e MOG. Uma comparação do envelope MOG identificou cinco domínios IgG-like de MOG-like estendendo a ideia de que o HERV-W pode estar envolvido na imunopatogênese da EM, talvez para facilitar o reconhecimento pelo sistema imune de regiões retrovirais MOG. Também mostramos que a maioria dos pacientes apresentou expressão do envelope HERV-W em algum nível. Nove das dez amostras testadas apresentaram níveis médios a altos de expressão do envelope de HERV-W contra níveis de expressão muito baixos ou nenhuma atividade em controles saudáveis, confirmando a associação entre atividade de MS e HERV-W em nossa população.

Um estudo recente na Itália mostrou que o EBV estimula a expressão de HERV-W em células do sangue e do cérebro in vitro. Eles sugerem que a patogênese da EM, um possível modelo poderia incluir o EBV como o gatilho inicial da EM, anos depois, e mostra o HERV-W como real para a patogenicidade da EM, em paralelo marcante com o comportamento da doença em sua forma remitente colaborador do recorrente.

Objetivos.

Objetivo primário: correlacionar a atividade clínica e de imagem da EM com a avaliação quantitativa de HERV-W e vírus da família Herpesviridae no sangue de pacientes com EM.

Objetivo Secundário:

Avalie a expressão de HERV-W e Herpesvírus e compare a expressão viral entre pacientes com EM e controles saudáveis ​​com e sem outras doenças neurológicas.

Significado:

A EM é uma doença multifatorial, com etiologia genética e ambiental. É grande o interesse dos pesquisadores em fatores associados para estabelecer uma relação causal. Vários vírus têm sido associados à patogênese e à atividade da doença. Embora os vírus herpesvírus e HERV-W sejam os mais importantes na tentativa de estabelecer uma relação causal e com a atividade da EM, até o momento muitas questões permanecem em aberto sobre o papel desses vírus na etiologia e desenvolvimento da doença.

Hipótese:

Com este trabalho espera-se encontrar mais respostas possíveis sobre a etiopatogenia e atividade inflamatória relacionada à EM, e assim, fornecer dados mais consistentes que auxiliem na formulação de terapias cada vez mais específicas e eficazes direcionadas a esta patologia.

Métodos:

Inicialmente, todas as amostras serão analisadas por imunoensaio ELISA para detecção de anticorpos IgG e imunoglobulina M (IgM) anti-EBV e CMV no soro dos participantes, utilizando kits comerciais.

Será realizada a extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA), conforme instruções do fabricante. Todos os protocolos para garantir a pureza do RNA e ausência de DNA nas amostras serão adotados na análise de expressão (e assim detecção de transcritos). Assim, os ácidos nucleicos são submetidos a tratamento com DNAse e verificação por RT-PCR HERV-W. Apenas amostras contendo RNA serão transcritas e submetidas a análises posteriores. A quantificação do RNA do HERV-W será feita em células mononucleares (PBMC) por reação quantitativa em cadeia da polimerase (qRT-PCR) específica para o subtipo MSRV da família HERV-W.

A detecção do DNA do herpesvírus será inicialmente feita por PCR, utilizando dois conjuntos de primers (HSVPAN e VZVPAN). Após a amplificação é realizada uma digestão enzimática com BamHI e BstUI para tipagem dos oito tipos de herpesvírus incluindo o herpesvírus humano 6 (6A e 6B). Para amostras positivas, será realizado um qRT-PCR para vírus específicos.

Projeto:

Será realizado um estudo prospectivo, longitudinal, com coleta de material biológico e presença de grupo controle. Este projeto será analisado pelos próprios, através do termo de consentimento livre e esclarecido. Somente assinando o termo de consentimento o paciente poderá participar desta pesquisa.

Amostras de sangue dos pacientes do ambulatório de neurologia (CATEM e outras especialidades) serão feitas durante consulta de rotina por um profissional habilitado. O sangue dos pacientes do Banco de Sangue será coletado juntamente com os exames realizados de rotina. Todo o material coletado será encaminhado ao laboratório de virologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, onde serão realizados exames laboratoriais.

Os pacientes serão avaliados quanto ao grau de atividade clínica e de imagem da doença pela análise da taxa anualizada de recidivas, aumentos na escala EDSS e aumento das lesões cranianas na RM e atividade da doença classificada como LEVE, MODERADA e SEVERA de acordo com os critérios propostos por Freedman et al. A ressonância magnética de crânio será realizada apenas para grupos com EM e com outras doenças neurológicas.

Métodos estatísticos:

Após os resultados dos exames laboratoriais, os dados serão analisados ​​e receberão o tratamento necessário para sua interpretação estatística e comparação com a atividade da doença por meio de ferramentas paramétricas e não paramétricas. Os testes t de Student e Mann-Whitney serão utilizados para avaliar associações entre parâmetros clínicos, demográficos e laboratoriais. Será fixado o nível de significância de alfa = 0,05 ou 5% para rejeitar a hipótese nula.

Cálculo do tamanho da amostra:

O tamanho da amostra foi determinado com base na porcentagem da população com e sem EM apresentando expressão detectável de HERV-W em PBMC. Embora o número de pacientes com EM que exibe envelope de retrovírus de atividade seja próximo a 95%, assumimos valores mais conservadores para o cálculo amostral. Portanto, assumindo a expressão em 50% e 10% para casos e controles, respectivamente, é necessário um tamanho amostral de 28 casos e 28 controles, com base em um nível de confiança = 95% poder para detectar 80%, de acordo com o método de Kelsey. Assim, como os investigadores irão analisar três grupos (com EM, sem EM e outras doenças neurológicas) o N total é de 84 indivíduos, 28 por grupo.