早産児における唾液遺伝子発現と経口摂食の体性感覚調節

この研究の目的は、実験的概念化アプローチで分子的および行動的方法を組み合わせて、絶妙に複雑な口腔運動スキル、つまり経口摂食の獲得のコンテキストで、唾液遺伝子発現に対する三叉神経 (パルス状の口腔皮膚) 体性感覚刺激の効果をマッピングすることです。ハイリスクヒト新生児において。 この研究の目的は、非侵襲的治療戦略と高リスク EPI のトランスクリプトーム評価を組み合わせて、(1) 経口摂食行動とスキルを改善し、(2) 関連する生物学的に多様な経路の遺伝子オントロジーの理解を深める最初の試みです。 (3) 遺伝子発現データを使用して、新生児のケアをパーソナライズし、治療戦略と介入のタイミングを個別化します。(4) 長期的な発達アウトカムを改善します。 経口哺乳へのこの統合的アプローチは、新生児ケアのパラダイム シフトであり、急速に出現する技術的進歩とパーソナライズされたトランスクリプトミクスを新生児のベッドサイドに安全かつ非侵襲的に導入して、医療の決定に情報を提供し、ケアと転帰を改善することができます。

方法 参加者: 妊娠 24 週 0/7 から 28 週 6/7 週の間に生まれた EPI のみが、産科超音波検査で 15 週未満または最終月経で決定され、この研究に参加する資格があります。 未熟児の深刻な後遺症を発症し、以下にリストされている基準に基づいてこの研究の対象とならない乳児の数を制限するために、修正PCAが29週間以上になったら、EPIを積極的に登録します。 登録された被験者の保護者には、参加に対して Babies R Us $50 のギフトカードが贈られます。 被験者は、1）CHI Health St. Elizabeth [リンカーン、NE]、2）Tufts Medical Center NICU [Boston、MA]、3）Santa Clara Valley Medical Center [San Jose、CA]、および 4) 小児病院オレンジ カントリー [カリフォルニア州ロサンゼルス] は、研究サイトの PI/共同研究者または新生児研究コーディネーターによるものです。 主治医および看護師と相談した後、参加者が研究に参加する前に、インフォームドコンセントが得られる。 合計 180 の EPI (ほぼ同数の男性と女性、人種/民族に基づく除外なし) が研究に参加します (検出力 >.85、タイプ I エラー <.05)。

除外基準：EPIは、次のいずれかがある場合、この研究に採用されません：1）頭蓋顔面奇形、神経系異常、チアノーゼ性先天性心疾患、胃分離症、臍帯ヘルニア、横隔膜ヘルニアおよび/またはその他の主要な胃腸を含む染色体および先天異常異常; 2) 先天性感染症、3) 記録された GA なし、4) 重度の IUGR (3%)、5) 頭囲 < 10 または > 90 パーセンタイル、頭蓋内出血グレード III および IV、発作、髄膜炎、異常を示す神経学的検査を含む異常な神経学的状態PCAのすべての四肢の緊張または動き; 6) 壊死性腸炎の病歴 (ステージ II および III); 7) 試験登録時の培養陽性敗血症。

プロトコル: EPI は、2 つの妊娠期間グループ (24 0/7 - 26 6/7 週、および 27 0/7 - 28 6/7 週) の間で階層化されます。 各乳児は、Minitab v.17 (www.minitab.com) のソフトウェア ランダム整数関数を使用して、PULSED NTrainer または SHAM 介入のいずれかを受けるように無作為化されます。 PULSED NTrainer グループに割り当てられた乳児は、パルス状の口腔皮膚刺激の漸進的な量を受けます。 30 週の PCA から始めて、これらの乳児は 2 週間の低用量パルス NTTrainer 刺激 (2 x 3 分のブロック) を受け、刺激ブロック間に 1 分間の刺激「オフ期間」があります。 この形態の刺激は、経管栄養と同時に 1 日 3 回与えられます。 その後、刺激量を次の 2 週間にわたって増加させます (パルス NTTrainer 刺激の 3 x 3 分間ブロック)。刺激ブロック間に 1 分間の刺激「オフ期間」を置き、1 日 3 回の経管栄養と同時に与えます。 . SHAM条件に無作為化されたEPIには、同じ期間の経管栄養中に通常のシリコンおしゃぶりが与えられます。

刺激ブロックの間に 1 分間の休息期間 (刺激なし) が発生します。 口腔皮膚療法の開始基準には次のようなものがあります。 2) 過去 48 時間の経腸栄養に耐える; 3) 挿管されておらず、機械的に換気されていない。 乳児が鼻間欠的陽圧換気、持続的気道陽圧または鼻カニューレを毎分 2 リットル以上使用している場合、FiO2 は 40% 未満でなければなりません。

NNS 評価および自動化された NNS デジタル信号処理と特徴抽出: 経口刺激介入 (PULSED NTtrainer 対 SHAM おしゃぶり) に加えて、すべての研究対象の乳児は、NNS のパフォーマンスについて週に 3 回 (例: M/W/F) 評価されます。 . NTrainer システムを「評価モード」で使用して、3 分間のセッション中に NNS の圧迫力学を記録し、介入条件に関連しない経管栄養の直前に行います。

吸引サイクル カウントに基づく NNS 動作の最も活発な 2 分間は、NTrainer システムの自動波形特徴抽出アルゴリズムを使用して、各吸引評価データ ファイルから自動的に抽出されます。 圧力ピーク > 1.6 cm H2O は、1200 ミリ秒以内に発生する 2 つ以上の NNS イベントとして定義される吸引サイクルの対称性、サイクル持続時間、バースト識別などの特徴抽出基準に従います。 このアルゴリズムは、おしゃぶりに対する非 NNS 口圧縮または舌の突き出しとは異なる NNS バースト活動の客観的な識別を可能にします。 (1) 個々のバーストに 2 つ以上の吸引サイクルが含まれる NNS バースト、(2) サイクル期間がそれより短い吸引圧縮サイクルとして定義される NNS サイクル イベントの分率を含む、4 つの測定値が、インデックス付きの吸引圧縮の記録から客観的に抽出されます。 1200 ミリ秒未満、(3) すべての圧力イベントの合計として定義される総口腔圧迫、および (4) cm H2O で表される NNS 圧迫圧力。

PO 給餌の進歩: EPI は、各サイトの NICU で利用される標準化されたキューベースの給餌スケジュールに基づいて進歩します。 サイト全体での経口摂取の進歩のこの標準化により、最終的にデータをゆがめる可能性のある交絡因子が制限されます。

唾液の収集、処理、および遺伝子発現分析: 唾液の収集: SHAM または PULSED NTrainer 介入を受ける前の初日に、すべての登録乳児から唾液サンプルが収集されます。 このサンプルは、ベースライン遺伝子発現プロファイルとして機能します。 サンプルは、週に 2 回 (〜 3 日間隔) 取得され、完全な経口摂取が達成されるまで、または経鼻胃管 (NG) またはガストロノミー チューブのいずれかを使用して退院します。

各サイトの唾液サンプルは、マロン研究所を通じて最適化および検証された技術で収集されます。 簡単に言えば、唾液サンプルは 1 mL シリンジで収集され、エンドキャップが取り外され、低壁吸引に取り付けられます。 唾液は約 20 秒間収集され、500 μL の Qiagen の RNA Protect Saliva で直ちに安定化され、遺伝子発現の変化を停止させ、破壊的な RNase を阻害し、微生物の異常増殖を制限します。 サンプルを短時間ボルテックスし、-20 ℃ で凍結します。凍結後、サンプルは、total RNA 抽出が必要になるまで最大 18 か月間安定です。 したがって、ネブラスカ州とサンタクララ州からのサンプルは、マサチューセッツ州ボストンのタフツ医療センターにある母子研究所のマロン研究所に一晩氷上で月に 1 回出荷され、処理されます。

唾液バイオバンクの生成: バイオバンク リポジトリを生成するために、登録されたすべての被験者から毎週 1 つの追加の唾液サンプルが取得されます。 研究対象者から毎週追加のサンプルを保存することで、データ ポイントの損失を確実に抑えることができます。 まだ特定されていない経口摂食成熟の有益な唾液バイオマーカーがあると予想されます。 マイクロアレイ遺伝子発現プラットフォームまたは RNASeq のいずれかでレトロスペクティブに調査できる追加の唾液サンプルのバイオバンクを生成することにより、遺伝子間相互作用および/または経口摂食に関連する転写調節プロセスに関する新しい仮説を発見する可能性があります。 EPI人口。

トータル RNA 抽出: マロン研究所で最適化された確立されたプロトコルを使用して、唾液サンプルからトータル RNA を抽出します。 RNA抽出は、メーカーの指示に従ってQIAGEN RNAProtect Saliva Miniキットで行われます。 ゲノム DNA のコンタミネーションを排除するために、各サンプルに対してカラム上で DNase 処理が行われます。 バイオバンクの一部であるサンプルは、将来の分析が必要になるまで-80°Cで凍結されます。 RT-qPCR 実験に使用されるサンプルは、最初に製造元の指示に従って Life Technologies SuperScript Vilo キットを使用して cDNA 変換を受けます。 ｃＤＮＡは、遺伝子発現分析が行われるまで、タフツ医療センターの母親幼児研究所で－８０℃で保存される。

遺伝子発現解析: この研究の目的のために、品質管理と遺伝子発現データの潜在的な正規化のために、9 つの遺伝子、対象の 6 つの標的遺伝子、および 3 つの参照遺伝子について各サンプルを調べます。 この研究で分析される遺伝子は、新生児の経口摂取に直接関連していることが以前に示されており、PLXNA1、PLXNA3、NPY2R、WNT3、AMPK、および NPHP4 が含まれます。 3 つの参照遺伝子には、GAPDH、HPRT1、および YWHAZ が含まれます。これらはすべて、進行中の PCA にわたって安定した遺伝子発現を維持することが示されています。 すべての cDNA サンプルは、9 つ​​の遺伝子すべてに対してカスタム TaqMan® PreAmp Master Mix を使用してターゲットを絞った前増幅を行います。 増幅へのこのターゲットを絞ったアプローチにより、バイアスを導入する可能性のあるトランスクリプトーム全体のすべての遺伝子ではなく、目的の遺伝子のみが増幅されることが保証されます。 次に、前増幅された cDNA を、Life Technologies Quant Studio 7 Flex リアルタイム PCR システムで TaqMan Fast Advance Master Mix を使用して PCR にかけます。 この機器は、タフツ メディカル センターの母子研究所に収容されており、最先端の PCR マシンおよびソフトウェア システムです。 この研究では、定量的リアルタイム PCR 実験 (MIQE) のガイドラインを公開するための最小限の情報を遵守するためにあらゆる努力が払われます。 すべてのサンプルは、適切な正と負のコントロールで重複して実行されます。

最初の遺伝子発現解析: すべての遺伝子発現データは、Quant Studio 7 Flex リアルタイム PCR システムで正規化されます。 3 つの参照遺伝子すべての増幅が成功したサンプルのみが分析で考慮されます。 以前は、遺伝子はバイナリ形式 (+/- 発現) で有益でした。 ただし、この研究の目的のために、デルタデルタサイクル閾値（ΔΔCt）法を使用して各標的遺伝子の相対的な遺伝子発現を計算する準備ができています。 MIQE ガイドラインに従って、3 つの参照遺伝子を正規化に使用し、各サンプルの Ct の幾何平均を決定して、相対的な遺伝子発現を計算します。

神経発達フォローアップ: 標準治療の一環として、各サイトは、18 ～ 24 か月の補正年齢 (CA) で EPI に関する Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Edition を完成させます。 対象となる主なサブテストには、細かい運動、粗大運動、認知、および言語が含まれます。 これらのデータは、記録され、分析され、新生児および出生後の摂食結果、遺伝子発現データ、および介入状態と関連付けられます。 さらに、頭囲、長さ、体重などの成長パラメータが記録されます。