Somatosensorische modulatie van speekselgenexpressie en orale voeding bij te vroeg geboren baby's

Het doel van deze studie is om moleculaire en gedragsmethoden te combineren in een experimentele conceptualiseringsbenadering om de effecten van trigeminale (PULSED orocutane) somatosensorische stimulatie op speekselgenexpressie in kaart te brengen in de context van het verwerven van een buitengewoon complexe oromotorische vaardigheid, namelijk orale voeding, bij menselijke pasgeborenen met een hoog risico. De doelstellingen van deze studie vertegenwoordigen de eerste poging om niet-invasieve behandelingsstrategieën en transcriptomische beoordelingen van EPI's met een hoog risico te combineren om (1) oraal voedingsgedrag en -vaardigheden te verbeteren, (2) ons begrip van de genontologie van biologisch diverse routes gerelateerd tot orale voeding, (3) genexpressiegegevens gebruiken om neonatale zorg te personaliseren en behandelstrategieën en timinginterventies te individualiseren, en (4) ontwikkelingsresultaten op de lange termijn verbeteren. Deze integrale benadering van orale voeding is een paradigmaverschuiving in de neonatale zorg, waarbij snel opkomende technologische ontwikkelingen en gepersonaliseerde transcriptomics veilig en niet-invasief naar het bed van de pasgeborene kunnen worden gebracht om beslissingen over medische zorg te onderbouwen en de zorg en resultaten te verbeteren.

Methoden Deelnemers: Alleen EPI's geboren tussen 24 0/7 en 28 6/7 weken zwangerschap, zoals bepaald door verloskundige echografie bij < 15 weken of laatste menstruatie, komen in aanmerking voor deelname aan dit onderzoek. We zullen EPI's actief inschrijven zodra ze een gecorrigeerde PCA van ≥ 29 weken hebben om het aantal baby's te beperken dat ernstige gevolgen van prematuriteit ontwikkelt en niet in aanmerking komt voor dit onderzoek op basis van de onderstaande criteria. Ouders van ingeschreven proefpersonen ontvangen een cadeaubon van Babies R Us $ 50 voor hun deelname. Onderwerpen zullen worden gerekruteerd uit vier neonatale intensive care-afdelingen, waaronder 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], en 4) Kinderziekenhuis Orange Country [Los Angeles, CA] door een onderzoekslocatie PI/co-onderzoeker of de neonatale onderzoekscoördinator. Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen voorafgaand aan deelname van de deelnemers aan het onderzoek, na overleg met de behandelende arts en verpleegkundige(s). In totaal zullen 180 EPI's (ongeveer evenveel mannen als vrouwen, geen uitsluiting op basis van ras/etniciteit) deelnemen aan het onderzoek (power >.85, Type I-fout <.05).

Uitsluitingscriteria: EPI's worden niet gerekruteerd voor dit onderzoek als ze een van de volgende symptomen hebben: 1) chromosomale en aangeboren afwijkingen, waaronder craniofaciale misvorming, afwijkingen aan het zenuwstelsel, cyanotische congenitale hartziekte, gastroschisis, omphalocele, diafragmatische hernia en/of andere ernstige gastro-intestinale aandoeningen. afwijkingen; 2) congenitale infectie, 3) geen gedocumenteerde GA, 4) ernstige IUGR (3%), 5) abnormale neurologische status inclusief hoofdomtrek < 10e of > 90e percentiel, intracraniële bloeding graad III en IV, toevallen, meningitis, neurologisch onderzoek vertoont abnormaal toon of bewegingen van alle extremiteiten voor PCA; 6) voorgeschiedenis van necrotiserende enterocolitis (stadium II en III); en 7) kweekpositieve sepsis op het moment van inschrijving voor de studie.

Protocol: EPI's worden gestratificeerd over twee zwangerschapsduurgroepen (24 0/7 - 26 6/7 weken en 27 0/7 - 28 6/7 weken). Elk kind wordt gerandomiseerd om ofwel de PULSED NTrainer ofwel de SHAM-interventie te krijgen met behulp van een softwarefunctie met willekeurige gehele getallen in Minitab v.17 (www.minitab.com). Baby's die zijn toegewezen aan de PULSED NTrainer-groep krijgen een progressieve dosis van de pulserende orocutane stimulatie. Vanaf 30 weken PCA krijgen deze baby's 2 weken laaggedoseerde PULSED NTrainer-stimulatie (2 blokken van 3 minuten) met een 'off-periode' van 1 minuut tussen de stimulatieblokken. Deze vorm van stimulatie wordt gelijktijdig met sondevoeding gegeven, 3 keer per dag. De stimulusdosis wordt dan gedurende de volgende 2 weken verhoogd (3 blokken van 3 minuten PULSED NTrainer-stimulatie) met een stimulus-'off-periode' van 1 minuut tussen de stimulatieblokken, ook gelijktijdig gegeven met sondevoeding 3 keer/dag . EPI's gerandomiseerd naar de SHAM-conditie krijgen een normale siliconen fopspeen tijdens sondevoeding gedurende dezelfde periode.

Tussen de stimulatieblokken vindt een rustperiode van 1 minuut (geen stimulatie) plaats. Criteria voor het starten van orocutane therapie zijn onder andere: 1) stabiele vitale functies en geen continue vasopressormedicatie; 2) verdraagt ​​enterale voedingen in de afgelopen 48 uur; en 3) niet geïntubeerd en mechanisch beademd. Als de baby nasale intermitterende positieve drukventilatie, continue positieve luchtwegdruk of neuscanule >2 liter per minuut krijgt, dan moet de FiO2 <40% zijn.

NNS-beoordeling en geautomatiseerde NNS digitale signaalverwerking en functie-extractie: Naast de orale stimulatie-interventies (PULSED NTrainer vs. SHAM-fopspeen), worden alle studiebaby's 3 keer per week beoordeeld (bijv. M/W/V) voor NNS-prestaties . Het NTrainer-systeem wordt gebruikt in de 'beoordelingsmodus' om de compressiedynamiek van NNS vast te leggen tijdens een sessie van 3 minuten, onmiddellijk voorafgaand aan een sondevoeding die niet is gekoppeld aan een interventieaandoening.

De meest actieve periode van 2 minuten van NNS-gedrag op basis van het aantal zuigcycli wordt automatisch geëxtraheerd uit elk zuigbeoordelingsgegevensbestand met behulp van een geautomatiseerd extractie-algoritme voor golfvormkenmerken op het NTrainer-systeem. Drukpieken > 1,6 cm H2O worden onderworpen aan kenmerkextractiecriteria, waaronder zuigcyclussymmetrie, cyclusduur en burst-identificatie gedefinieerd als twee of meer NNS-gebeurtenissen die binnen 1200 ms plaatsvinden. Dit algoritme maakt objectieve identificatie mogelijk van NNS-burst-activiteit die verschilt van niet-NNS-mondcompressies of tongstoten tegen de fopspeen. Vier maten zullen objectief worden geëxtraheerd uit de geïndexeerde records van zuigcompressie, inclusief minuutsnelheden voor (1) NNS-bursts waarbij een individuele burst 2 of meer zuigcycli omvat, (2) NNS-cyclusgebeurtenissen gedefinieerd als zuigcompressiecycli met minder cyclusperioden dan 1200 ms, (3) Totale orale compressies gedefinieerd als de som van alle drukgebeurtenissen, en (4) NNS-compressiedruk uitgedrukt in cm H2O.

PO-voedingsvooruitgang: EPI's gaan verder volgens een gestandaardiseerd, op cues gebaseerd voedingsschema dat door elke NICU-locatie wordt gebruikt, bekend als Infant Driven Feeding®, dat zal leiden tot volledige tepelvoeding. Deze standaardisatie van de vooruitgang op het gebied van orale voeding op verschillende locaties zal confounders beperken die uiteindelijk de gegevens kunnen vertekenen.

Speekselverzameling, -verwerking en analyse van genexpressie: Speekselverzameling: Speekselmonsters worden verzameld van alle ingeschreven baby's op de eerste dag voorafgaand aan de SHAM- of PULSED NTrainer-interventie. Dit voorbeeld zal dienen als ons baseline genexpressieprofiel. Vervolgens worden tweemaal per week monsters genomen (~ 3 dagen tussenpozen) tot het moment waarop volledige orale voedingen zijn bereikt of het ziekenhuis wordt ontslagen met een neussonde (NG) of gastronomiesonde.

Speekselmonsters op elke locatie zullen worden verzameld met technieken die zijn geoptimaliseerd en gevalideerd door het Maron-laboratorium. In het kort worden speekselmonsters verzameld met een injectiespuit van 1 ml, de einddoppen worden verwijderd en bevestigd aan een laagwandige afzuiging. Speeksel wordt gedurende ongeveer 20 seconden verzameld en onmiddellijk gestabiliseerd in 500 μl Qiagen's RNA Protect Saliva om veranderingen in genexpressie te stoppen, destructieve RNases te remmen en microbiële overgroei te beperken. Monsters worden kort gevortext en ingevroren bij -20 °C. Eenmaal ingevroren, zijn monsters tot 18 maanden stabiel voordat totale RNA-extractie nodig is. Zo zullen monsters uit Nebraska en Santa Clara eens per maand 's nachts op ijs worden verzonden naar het Maron-laboratorium van het Mother Infant Research Institute in Tufts Medical Center in Boston, MA voor verwerking.

Genereren van een speekselbiobank: er wordt elke week één extra speekselmonster afgenomen van alle ingeschreven proefpersonen om een ​​biobankrepository te genereren. Door elke week een extra monster van proefpersonen te verzamelen, zorgen we ervoor dat we het verlies van datapunten beperken. We verwachten dat er informatieve speekselbiomarkers zijn voor de rijping van orale voeding die nog moeten worden geïdentificeerd. Door een biobank van aanvullende speekselmonsters te genereren die retrospectief kunnen worden ondervraagd op ofwel een microarray-genexpressieplatform of met RNASeq, zullen we het potentieel hebben om nieuwe hypothesen te ontdekken over gen-gen-interacties en/of transcriptionele regulerende processen gerelateerd aan orale voeding in de EPI-bevolking.

Totale RNA-extractie: speekselmonsters worden geëxtraheerd voor totaal RNA met behulp van gevestigde protocollen die zijn geoptimaliseerd in het Maron-laboratorium. RNA-extractie vindt plaats met de QIAGEN RNAProtect Saliva Mini-kit volgens de instructies van de fabrikant. Op de kolom wordt voor elk monster een DNase-behandeling uitgevoerd om besmetting met genomisch DNA te elimineren. Monsters die deel uitmaken van de biobank zullen worden ingevroren bij -80°C in afwachting van toekomstige analyse. Monsters die zullen worden gebruikt voor RT-qPCR-experimenten zullen eerst cDNA-conversie ondergaan met de Life Technologies SuperScript Vilo-kit volgens de instructies van de fabrikant. cDNA zal worden opgeslagen bij -80°C in het Mother Infant Research Institute in Tufts Medical Center in afwachting van analyse van genexpressie.

Analyse van genexpressie: voor het doel van deze studie zullen we elk monster ondervragen op negen genen, zes doelgenen van interesse en drie referentiegenen voor kwaliteitscontrole en mogelijke normalisatie van genexpressiegegevens. Van genen die in dit onderzoek moeten worden geanalyseerd, is eerder aangetoond dat ze direct verband houden met orale voeding bij de pasgeborene en omvatten PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK en NPHP4. De drie referentiegenen omvatten GAPDH, HPRT1 en YWHAZ, waarvan is aangetoond dat ze allemaal stabiele genexpressie behouden tijdens voortschrijdende PCA. Alle cDNA-monsters ondergaan een gerichte voorversterking met een aangepaste TaqMan® PreAmp Master Mix voor alle negen genen. Deze gerichte benadering van amplificatie zal ervoor zorgen dat alleen die genen van interesse worden geamplificeerd en niet alle genen in het transcriptoom die vooringenomenheid kunnen introduceren. Voorversterkt cDNA zal vervolgens PCR ondergaan met TaqMan Fast Advance Master Mix op het Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR-systeem. Dit instrument is ondergebracht bij het Mother Infant Research Institute in het Tufts Medical Center en is een geavanceerd ultramodern PCR-apparaat en softwaresysteem. Alles zal in het werk worden gesteld om te voldoen aan de richtlijnen voor minimale informatie voor publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten (MIQE) voor deze studie. Alle monsters worden in tweevoud uitgevoerd met de juiste positieve en negatieve controles.

Initiële genexpressieanalyses: alle genexpressiegegevens worden genormaliseerd op het Quant Studio 7 Flex real-time PCR-systeem. Alleen monsters met succesvolle amplificatie van alle drie de referentiegenen worden in de analyse meegenomen. Voorheen waren genen informatief op een binaire manier (+/- expressie). Voor het doel van deze studie zullen we echter bereid zijn om de relatieve genexpressie van elk doelgen te berekenen met de delta delta cycle threshold (ΔΔCt) methode. In overeenstemming met de MIQE-richtlijnen zullen we de drie referentiegenen gebruiken voor normalisatie en een geometrisch gemiddelde van hun Ct in elk monster bepalen om de relatieve genexpressie te berekenen.

Neurologische follow-up: Als onderdeel van de zorgstandaard zal elke locatie de Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Edition invullen, op EPI's op de gecorrigeerde leeftijd (CA) van 18 tot 24 maanden. De primaire subtests die van belang zijn, zijn fijne motoriek, grove motoriek, cognitie en taal. Deze gegevens zullen worden geregistreerd, geanalyseerd en gecorreleerd met voedingsresultaten in de neo- en postnatale periode, genexpressiegegevens en interventiestatus. Daarnaast worden groeiparameters als hoofdomtrek, lengte en gewicht geregistreerd.