Соматосенсорная модуляция экспрессии генов слюны и пероральное кормление у недоношенных детей

Целью данного исследования является объединение молекулярных и поведенческих методов в подходе к экспериментальной концептуализации для картирования эффектов соматосенсорной стимуляции тройничного нерва (PULSED или оро-кожной) на экспрессию генов слюны в контексте приобретения чрезвычайно сложного оромоторного навыка, а именно орального кормления, у новорожденных из группы высокого риска. Цели этого исследования представляют собой первую попытку объединить неинвазивные стратегии лечения и транскриптомные оценки EPI высокого риска, чтобы (1) улучшить поведение и навыки орального питания, (2) углубить наше понимание генной онтологии биологически разнообразных путей, связанных с к пероральному кормлению, (3) использовать данные об экспрессии генов для персонализации ухода за новорожденными и индивидуализировать стратегии лечения и временные вмешательства, а также (4) улучшить долгосрочные результаты развития. Этот интегративный подход к пероральному кормлению представляет собой смену парадигмы в неонатальной помощи, когда быстро развивающиеся технологические достижения и персонализированная транскриптомика могут безопасно и неинвазивно применяться у постели новорожденного для обоснования решений о медицинском обслуживании и улучшения ухода и результатов.

Методы. Участники. В этом исследовании могут участвовать только женщины, родившиеся в период между 24 0/7 и 28 6/7 недель беременности, что определяется акушерским ультразвуковым исследованием на сроке < 15 недель или последней менструации. Мы будем активно включать EPI, как только у них будет скорректированный PCA ≥ 29 недель, чтобы ограничить количество детей, у которых разовьются серьезные последствия недоношенности и которые не будут соответствовать критериям для участия в этом исследовании на основании критериев, перечисленных ниже. Родители зарегистрированных субъектов получат подарочную карту Babies R Us на 50 долларов за свое участие. Субъекты будут набраны из четырех отделений интенсивной терапии новорожденных, включая 1) CHI Health St. Elizabeth [Линкольн, Небраска], 2) Медицинский центр Тафтса, отделение интенсивной терапии [Бостон, Массачусетс], 3) Медицинский центр долины Санта-Клара [Сан-Хосе, Калифорния], и 4) Детская больница Orange Country [Лос-Анджелес, Калифорния] PI/Co-исследователем исследовательского центра или координатором неонатального исследования. Информированное согласие будет получено до включения участников в исследование после консультации с лечащим врачом и медсестрой (медсестрами). Всего в исследовании примут участие 180 EPI (приблизительно равное количество мужчин и женщин, без исключения по признаку расы/этнической принадлежности) (мощность > 0,85, ошибка типа I < 0,05).

Критерии исключения: РПИ не будут привлекаться к участию в этом исследовании, если у них имеется любое из следующего: 1) хромосомные и врожденные аномалии, включая черепно-лицевые пороки развития, аномалии нервной системы, цианотичный врожденный порок сердца, гастрошизис, омфалоцеле, диафрагмальная грыжа и/или другие крупные желудочно-кишечные заболевания. аномалии; 2) врожденная инфекция, 3) отсутствие документированного гестационного возраста, 4) тяжелая ЗВУР (3%), 5) аномальный неврологический статус, включая окружность головы < 10-го или > 90-го процентиля, внутричерепное кровоизлияние III и IV степени, судороги, менингит, неврологическое исследование показывает отклонения тонус или движения всех конечностей при РПЖ; 6) некротический энтероколит в анамнезе (II и III стадии); и 7) культурально-положительный сепсис на момент включения в исследование.

Протокол: РПИ будут стратифицированы по двум возрастным группам гестации (24 0/7–26 6/7 недель и 27 0/7–28 6/7 недель). Каждый младенец будет рандомизирован для получения либо вмешательства PULSED NTrainer, либо вмешательства SHAM с использованием программной функции случайных целых чисел в Minitab v.17 (www.minitab.com). Младенцы, отнесенные к группе PULSED NTrainer, будут получать прогрессивную дозу пульсирующей оро-кожной стимуляции. Начиная с 30-й недели PCA, эти младенцы будут получать 2 недели стимуляции PULSED NTrainer в низких дозах (2 блока по 3 минуты) с 1-минутным «периодом отключения» стимуляции между блоками стимуляции. Эта форма стимуляции будет проводиться одновременно с кормлением через зонд 3 раза в день. Затем доза стимула будет увеличена в течение следующих 2 недель (3 x 3-минутных блока стимуляции PULSED NTrainer) с 1-минутным «периодом отключения» стимула между блоками стимуляции, которые также даются одновременно с кормлением через зонд 3 раза в день. . EPI, рандомизированные в состояние SHAM, будут получать обычную силиконовую пустышку во время кормления через зонд в течение того же периода времени.

Между блоками стимуляции следует 1-минутный период отдыха (без стимуляции). Критерии для начала перорально-кожной терапии включают следующее: 1) стабильные показатели жизнедеятельности и отсутствие непрерывного приема вазопрессорных препаратов; 2) переносимость энтерального питания в предыдущие 48 часов; 3) не интубированные и не находящиеся на ИВЛ. Если младенец находится на назальной прерывистой вентиляции с положительным давлением, постоянном положительном давлении в дыхательных путях или назальной канюле >2 литров в минуту, то FiO2 должен быть <40%.

Оценка NNS и автоматизированная обработка цифрового сигнала NNS и извлечение признаков: в дополнение к вмешательствам по оральной стимуляции (PULSED NTtrainer по сравнению с пустышкой SHAM) все исследуемые младенцы будут оцениваться 3 раза в неделю (например, M/W/Ж) на предмет производительности NNS. . Система NTrainer будет использоваться в «режиме оценки» для записи динамики компрессии NNS в течение 3-минутного сеанса непосредственно перед кормлением через зонд, не связанным с вмешательством.

Наиболее активный 2-минутный период поведения NNS, основанный на подсчете циклов сосания, автоматически извлекается из каждого файла данных оценки сосания с использованием алгоритма автоматического извлечения характеристик сигнала в системе NTrainer. Пики давления > 1,6 см вод. Этот алгоритм позволяет объективно идентифицировать взрывную активность СНС, отличную от компрессий рта, не связанных с СНС, или толчков языка к соске. Четыре измерения будут объективно извлечены из проиндексированных записей о сжатии всасывания, включая минутные скорости для (1) пакетов NNS, где отдельный пакет включает 2 или более циклов всасывания, (2) событий цикла NNS, определяемых как циклы сжатия всасывания с периодами цикла менее чем 1200 мс, (3) общее оральное сжатие, определенное как сумма всех событий давления, и (4) давление сжатия NNS, выраженное в см H2O.

PO Улучшение кормления: EPI будут продвигаться по стандартизированному графику кормления на основе сигналов, используемому в каждом отделении интенсивной терапии новорожденных, известному как Infant Driven Driven Feeding®, который приведет к полному кормлению сосков. Эта стандартизация достижений в области перорального питания на разных сайтах ограничит влияние искажающих факторов, которые в конечном итоге могут исказить данные.

Сбор слюны, обработка и анализ экспрессии генов: Сбор слюны: Образцы слюны будут собираться у всех зарегистрированных младенцев в первый день до проведения вмешательства SHAM или PULSED NTtrainer. Этот образец будет служить нашим базовым профилем экспрессии генов. Затем образцы будут браться два раза в неделю (с интервалом ~ 3 дня) до момента достижения полного перорального питания или выписки домой из больницы либо через назогастральный зонд (НГ), либо через гастрономический зонд.

Образцы слюны на каждом участке будут собираться с использованием методов, оптимизированных и проверенных лабораторией Maron. Вкратце, образцы слюны будут собираться с помощью шприца объемом 1 мл со снятыми торцевыми крышками и прикрепленными к низкостенному отсосу. Слюна будет собираться в течение примерно 20 секунд и немедленно стабилизироваться в 500 мкл Qiagen's RNA Protect Saliva, чтобы остановить изменения экспрессии генов, ингибировать деструктивные РНКазы и ограничить разрастание микробов. Образцы будут кратковременно встряхиваться и заморожены при температуре -20°C. После замораживания образцы остаются стабильными до 18 месяцев до необходимости экстракции общей РНК. Таким образом, образцы из Небраски и Санта-Клары будут отправляться один раз в месяц на льду в ночное время в лабораторию Марона в Научно-исследовательском институте матери и ребенка в Медицинском центре Тафтса в Бостоне, Массачусетс, для обработки.

Создание биобанка слюны: Каждую неделю от всех зарегистрированных субъектов будет браться один дополнительный образец слюны для создания репозитория биобанка. Еженедельное хранение дополнительной выборки от испытуемых гарантирует, что мы ограничим потерю точек данных. Мы ожидаем, что существуют информативные слюнные биомаркеры созревания орального питания, которые еще предстоит идентифицировать. Создав биобанк дополнительных образцов слюны, которые можно ретроспективно исследовать либо на платформе экспрессии генов микрочипов, либо с помощью RNASeq, мы получим возможность открыть новые гипотезы о взаимодействиях генов и/или процессах регуляции транскрипции, связанных с пероральным питанием в организме человека. Население ЭПИ.

Экстракция общей РНК: Образцы слюны будут извлечены для определения общей РНК с использованием установленных протоколов, оптимизированных в лаборатории Марона. Выделение РНК будет происходить с помощью набора QIAGEN RNAProtect Saliva Mini в соответствии с инструкциями производителя. На колонке обработка ДНКазой будет проводиться для каждого образца, чтобы исключить загрязнение геномной ДНК. Образцы, входящие в состав биобанка, будут заморожены при температуре -80°C в ожидании дальнейшего анализа. Образцы, которые будут использоваться для экспериментов RT-qPCR, сначала будут подвергнуты преобразованию кДНК с помощью набора Life Technologies SuperScript Vilo в соответствии с инструкциями производителя. кДНК будет храниться при температуре -80 ° C в Исследовательском институте матери и ребенка в Медицинском центре Тафтса до проведения анализа экспрессии генов.

Анализ экспрессии генов. В целях данного исследования мы проверим каждый образец на наличие девяти генов, шести представляющих интерес генов-мишеней и трех эталонных генов для контроля качества и возможной нормализации данных об экспрессии генов. Ранее было показано, что гены, которые будут проанализированы в этом исследовании, напрямую связаны с оральным кормлением у новорожденных и включают PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK и NPHP4. Три референсных гена включают GAPDH, HPRT1 и YWHAZ, все из которых, как было показано, поддерживают стабильную экспрессию генов при развитии PCA. Все образцы кДНК будут подвергаться целенаправленной предварительной амплификации с использованием специальной смеси TaqMan® PreAmp Master Mix для всех девяти генов. Этот целенаправленный подход к амплификации гарантирует, что будут амплифицированы только те гены, которые представляют интерес, а не все гены в транскриптоме, что может привести к систематической ошибке. Предварительно амплифицированная кДНК затем подвергается ПЦР с TaqMan Fast Advance Master Mix в системе ПЦР в реальном времени Life Technologies Quant Studio 7 Flex. Этот прибор находится в Научно-исследовательском институте матери и ребенка в Медицинском центре Тафтса и представляет собой передовую современную машину для ПЦР и систему программного обеспечения. Будут предприняты все усилия, чтобы придерживаться рекомендаций «Минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» (MIQE) для этого исследования. Все образцы будут запускаться в двух экземплярах с соответствующими положительными и отрицательными контролями.

Первоначальный анализ экспрессии генов. Все данные об экспрессии генов будут нормализованы в системе ПЦР в реальном времени Quant Studio 7 Flex. В анализе будут рассматриваться только образцы, в которых успешно амплифицированы все три эталонных гена. Ранее гены были информативны бинарным образом (+/- экспрессия). Однако для целей этого исследования мы будем готовы рассчитать относительную экспрессию каждого гена-мишени с помощью метода порога дельта-дельта-цикла (ΔΔCt). В соответствии с рекомендациями MIQE мы будем использовать три эталонных гена для нормализации и определим среднее геометрическое их Ct в каждом образце для расчета относительной экспрессии генов.

Последующее наблюдение за развитием нервной системы. В рамках стандарта лечения в каждом учреждении будет проведено заполнение шкалы развития младенцев и детей раннего возраста Бейли, 3-е издание, по EPI в возрасте от 18 до 24 месяцев скорректированного возраста (CA). Основные подтесты, представляющие интерес, включают мелкую моторику, общую моторику, познание и язык. Эти данные будут записаны, проанализированы и сопоставлены с результатами кормления в нео- и постнатальном периоде, данными об экспрессии генов и статусом вмешательства. Кроме того, будут регистрироваться параметры роста, включая окружность головы, длину и вес.