Modulação somatossensorial da expressão gênica salivar e alimentação oral em prematuros

O objetivo deste estudo é combinar métodos moleculares e comportamentais em uma abordagem de conceituação experimental para mapear os efeitos da estimulação somatossensorial trigeminal (PULSED orocutâneo) na expressão gênica salivar no contexto da aquisição de uma habilidade oromotora requintadamente complexa, ou seja, alimentação oral, em neonatos humanos de alto risco. Os objetivos deste estudo representam a primeira tentativa de combinar estratégias de tratamento não invasivas e avaliações transcriptômicas de EPIs de alto risco para (1) melhorar o comportamento e as habilidades de alimentação oral, (2) aprofundar nossa compreensão da ontologia genética de vias biologicamente diversas relacionadas à alimentação oral, (3) usar dados de expressão gênica para personalizar os cuidados neonatais e individualizar estratégias de tratamento e intervenções de tempo, e (4) melhorar os resultados de desenvolvimento a longo prazo. Esta abordagem integrativa para a alimentação oral é uma mudança de paradigma no cuidado neonatal, onde os avanços tecnológicos emergentes e a transcriptômica personalizada podem ser trazidos de forma segura e não invasiva para o leito neonatal para informar as decisões de cuidados médicos e melhorar os cuidados e resultados.

Métodos Participantes: Apenas IPEs nascidos entre 24 0/7 e 28 6/7 semanas de gestação, conforme determinado por ultrassonografia obstétrica em < 15 semanas ou no último período menstrual, são elegíveis para participar deste estudo. Inscreveremos ativamente os EPIs assim que tiverem um PCA corrigido de ≥ 29 semanas para limitar o número de bebês que desenvolvem sequelas graves de prematuridade e não seriam elegíveis para este estudo com base nos critérios listados abaixo. Os pais dos participantes inscritos receberão um cartão-presente Babies R Us $ 50 por sua participação. Os indivíduos serão recrutados em quatro unidades de terapia intensiva neonatal, incluindo 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], e 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] por um PI/Co-investigador do local do estudo ou pelo coordenador do estudo neonatal. O consentimento informado será obtido antes da entrada dos participantes no estudo, após consulta com o médico assistente e enfermeiro(s). Um total de 180 EPIs (números aproximadamente iguais de homens e mulheres, sem exclusão baseada em raça/etnia) participarão do estudo (poder >.85, erro tipo I <.05).

Critérios de exclusão: EPIs não serão recrutados para este estudo se tiverem qualquer um dos seguintes: 1) anomalias cromossômicas e congênitas, incluindo malformação craniofacial, anomalias do sistema nervoso, doença cardíaca congênita cianótica, gastrosquise, onfalocele, hérnia diafragmática e/ou outras doenças gastrointestinais importantes anomalias; 2) infecção congênita, 3) sem IG documentada, 4) RCIU grave (3%), 5) estado neurológico anormal, incluindo circunferência da cabeça < 10º ou > percentil 90, hemorragia intracraniana graus III e IV, convulsões, meningite, exame neurológico mostrando anormal tônus ​​ou movimentos de todas as extremidades para PCA; 6) história de enterocolite necrosante (estágios II e III); e, 7) sepse com cultura positiva no momento da inclusão no estudo.

Protocolo: Os IPEs serão estratificados entre dois grupos de idade gestacional (24 0/7 - 26 6/7 semanas e 27 0/7 - 28 6/7 semanas). Cada bebê será randomizado para receber a intervenção PULSED NTrainer ou SHAM usando uma função de número inteiro aleatório do software no Minitab v.17 (www.minitab.com). Os bebês designados para o grupo PULSED NTrainer receberão uma dose progressiva de estimulação orocutânea pulsátil. A partir de 30 semanas de PCA, esses bebês receberão 2 semanas de estimulação PULSED NTrainer de baixa dosagem (2 blocos de 3 minutos) com um período de intervalo de 1 minuto entre os blocos de estimulação. Esta forma de estimulação será dada simultaneamente com alimentação por sonda 3 vezes/dia. A dose de estímulo será então aumentada ao longo das próximas 2 semanas (blocos de 3 x 3 minutos de estimulação PULSED NTrainer) com um estímulo de 1 minuto 'fora do período' entre os blocos de estimulação, também administrado simultaneamente com alimentação por sonda 3 vezes/dia . Os EPIs randomizados para a condição SHAM receberão uma chupeta de silicone regular durante a alimentação por sonda durante o mesmo período de tempo.

Um período de descanso de 1 minuto (sem estimulação) ocorre entre os blocos de estimulação. Os critérios para início da terapia orocutânea incluem: 1) sinais vitais estáveis ​​e não uso de medicamentos vasopressores contínuos; 2) tolerar alimentação enteral nas últimas 48 horas; e 3) não intubado e ventilado mecanicamente. Se o lactente estiver em ventilação com pressão positiva intermitente nasal, pressão positiva contínua nas vias aéreas ou cânula nasal > 2 litros por minuto, a FiO2 deve ser < 40%.

Avaliação de NNS e processamento automatizado de sinais digitais de NNS e extração de recursos: além das intervenções de estimulação oral (PULSED NTrainer vs. chupeta SHAM), todos os bebês do estudo serão avaliados 3 vezes/semana (por exemplo, M/W/F) para desempenho de NNS . O sistema NTrainer será usado no 'modo de avaliação' para registrar a dinâmica de compressão do SNN durante uma sessão de 3 minutos para preceder imediatamente uma alimentação por sonda que não esteja associada a uma condição de intervenção.

O período mais ativo de 2 minutos do comportamento NNS com base na contagem do ciclo de sucção é extraído automaticamente de cada arquivo de dados de avaliação de sucção usando um algoritmo automatizado de extração de recursos de forma de onda no Sistema NTrainer. Os picos de pressão > 1,6 cm H2O estão sujeitos a critérios de extração de recursos, incluindo simetria do ciclo de sucção, duração do ciclo e identificação de explosão definida como dois ou mais eventos NNS ocorrendo em 1200 ms. Este algoritmo permite a identificação objetiva da atividade de rajada de NNS distinta das compressões de boca não-NNS ou impulsos de língua contra a chupeta. Quatro medidas serão extraídas objetivamente dos registros indexados de compressão de sucção, incluindo taxas de minuto para (1) NNS Bursts onde uma explosão individual inclui 2 ou mais ciclos de sucção, (2) Eventos de ciclo NNS definidos como ciclos de compressão de sucção com períodos de ciclo menores superior a 1200 ms, (3) Compressões orais totais definidas como a soma de todos os eventos de pressão e (4) Pressão de compressão NNS expressa em cm H2O.

Avanço da alimentação PO: os EPIs avançarão em um cronograma de alimentação padronizado baseado em sugestões utilizado por cada UTIN do local, conhecido como Infant Driven Feeding®, que levará a mamadas completas. Essa padronização dos avanços da alimentação oral nos locais limitará os fatores de confusão que podem, em última instância, distorcer os dados.

Coleta, processamento e análise de expressão gênica de saliva: Coleta de saliva: amostras de saliva serão coletadas de todos os bebês inscritos no primeiro dia antes de receber a intervenção SHAM ou PULSED NTrainer. Esta amostra servirá como nosso perfil de expressão gênica de linha de base. As amostras serão então obtidas duas vezes por semana (intervalos de ~ 3 dias) até o momento da obtenção de alimentação oral completa ou alta do hospital para casa com sonda nasogástrica (NG) ou sonda gastronômica.

Amostras de saliva em cada local serão coletadas com técnicas que foram otimizadas e validadas pelo laboratório Maron. Resumidamente, as amostras de saliva serão coletadas com uma seringa de 1 mL, as tampas das extremidades removidas e conectadas à sucção de parede baixa. A saliva será coletada por aproximadamente 20 segundos e imediatamente estabilizada em 500 μL de RNA Protect Saliva da Qiagen para interromper as alterações na expressão gênica, inibir RNases destrutivas e limitar o supercrescimento microbiano. As amostras serão agitadas brevemente e congeladas a -20 graus C. Uma vez congeladas, as amostras permanecem estáveis ​​por até 18 meses antes da necessidade de extração total de RNA. Assim, amostras de Nebraska e Santa Clara serão enviadas uma vez por mês em gelo durante a noite para o laboratório Maron no Mother Infant Research Institute no Tufts Medical Center em Boston, MA para processamento.

Geração de um Biobanco de Saliva: Uma amostra adicional de saliva será obtida a cada semana de todos os indivíduos inscritos para gerar um repositório de biobanco. Depositar uma amostra adicional a cada semana dos sujeitos do estudo garantirá que limitaremos a perda de pontos de dados. Prevemos que existem biomarcadores salivares informativos da maturação da alimentação oral que ainda precisam ser identificados. Ao gerar um biobanco de amostras adicionais de saliva que podem ser interrogadas retrospectivamente em uma plataforma de expressão gênica de microarray ou com RNASeq, teremos o potencial de descobrir novas hipóteses sobre interações gene-gene e/ou processos regulatórios transcricionais relacionados à alimentação oral no população EPI.

Extração de RNA total: As amostras salivares serão extraídas para RNA total usando protocolos estabelecidos otimizados no laboratório Maron. A extração de RNA ocorrerá com o kit QIAGEN RNAProtect Saliva Mini de acordo com as instruções do fabricante. Na coluna, o tratamento com DNase será realizado para cada amostra para eliminar a contaminação do DNA genômico. As amostras que fazem parte do biobanco serão congeladas a -80°C, aguardando a necessidade de análises futuras. As amostras que serão usadas para experimentos de RT-qPCR passarão primeiro pela conversão de cDNA com o kit Life Technologies SuperScript Vilo de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA será armazenado a -80°C no Mother Infant Research Institute no Tufts Medical Center enquanto se aguarda a análise da expressão gênica.

Análise de Expressão Gênica: Para o propósito deste estudo, iremos interrogar cada amostra para nove genes, seis genes alvo de interesse e três genes de referência para controle de qualidade e potencial normalização dos dados de expressão gênica. Os genes a serem analisados ​​neste estudo já demonstraram estar diretamente ligados à alimentação oral no recém-nascido e incluem PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK e NPHP4. Os três genes de referência incluem GAPDH, HPRT1 e YWHAZ, todos os quais demonstraram manter a expressão gênica estável em PCA avançado. Todas as amostras de cDNA passarão por uma pré-amplificação direcionada com um TaqMan® PreAmp Master Mix personalizado para todos os nove genes. Essa abordagem direcionada à amplificação garantirá que apenas os genes de interesse sejam amplificados e não todos os genes do transcriptoma que possam introduzir viés. O cDNA pré-amplificado será então submetido a PCR com TaqMan Fast Advance Master Mix no sistema Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR. Este instrumento está alojado no Mother Infant Research Institute no Tufts Medical Center e é uma máquina de PCR avançada e um sistema de software avançado. Todos os esforços serão feitos para aderir às diretrizes de informações mínimas para publicação de experimentos de PCR quantitativo em tempo real (MIQE) para este estudo. Todas as amostras serão executadas em duplicata com controles positivos e negativos apropriados.

Análises iniciais de expressão gênica: Todos os dados de expressão gênica serão normalizados no sistema de PCR em tempo real Quant Studio 7 Flex. Somente as amostras que tiverem amplificação bem-sucedida de todos os três genes de referência serão consideradas na análise. Anteriormente, os genes eram informativos de forma binária (+/- expressão). No entanto, para o propósito deste estudo, estaremos preparados para calcular a expressão gênica relativa de cada gene alvo com o método delta delta cycle threshold (ΔΔCt). De acordo com as diretrizes do MIQE, usaremos os três genes de referência para normalização e determinaremos uma média geométrica de seus Ct em cada amostra para calcular a expressão gênica relativa.

Acompanhamento do neurodesenvolvimento: Como parte do atendimento padrão, cada centro preencherá a 3ª edição da Escala Bayley de Desenvolvimento Infantil e Infantil, em EPIs na idade corrigida (CA) de 18 a 24 meses. Os principais subtestes de interesse incluem Motor Fino, Motor Grosso, Cognição e Linguagem. Esses dados serão registrados, analisados ​​e correlacionados com os resultados da alimentação no período neo e pós-natal, dados de expressão gênica e estado de intervenção. Além disso, parâmetros de crescimento, incluindo circunferência da cabeça, comprimento e peso, serão registrados.