Somatosensorische Modulation der Genexpression im Speichel und orale Ernährung bei Frühgeborenen

Der Zweck dieser Studie ist es, molekulare und Verhaltensmethoden in einem experimentellen Konzeptualisierungsansatz zu kombinieren, um die Auswirkungen der somatosensorischen Stimulation des Trigeminus (PULSED orokutan) auf die Genexpression im Speichel im Zusammenhang mit dem Erwerb einer äußerst komplexen oromotorischen Fähigkeit, nämlich der oralen Nahrungsaufnahme, abzubilden. bei Hochrisiko-Neugeborenen. Die Ziele dieser Studie stellen den ersten Versuch dar, nicht-invasive Behandlungsstrategien und transkriptomische Bewertungen von Hochrisiko-EPIs zu kombinieren, um (1) das Verhalten und die Fähigkeiten der oralen Nahrungsaufnahme zu verbessern und (2) unser Verständnis der Genontologie biologisch unterschiedlicher Signalwege zu erweitern zur oralen Ernährung, (3) Nutzung von Genexpressionsdaten zur Personalisierung der Neugeborenenversorgung und zur Individualisierung von Behandlungsstrategien und zeitlichen Interventionen und (4) Verbesserung der langfristigen Entwicklungsergebnisse. Dieser integrative Ansatz zur oralen Ernährung ist ein Paradigmenwechsel in der Neugeborenenversorgung, bei dem schnell aufkommende technologische Fortschritte und personalisierte Transkriptomik sicher und nicht-invasiv an das Neugeborenenbett gebracht werden können, um medizinische Versorgungsentscheidungen zu informieren und die Versorgung und Ergebnisse zu verbessern.

Methoden Teilnehmer: Nur EPIs, die zwischen 24 0/7 und 28 6/7 Schwangerschaftswochen geboren wurden, wie durch geburtshilflichen Ultraschall bei < 15 Wochen oder letzter Menstruationsperiode bestimmt, sind zur Teilnahme an dieser Studie berechtigt. Wir werden EPIs aktiv aufnehmen, sobald sie eine korrigierte PCA von ≥ 29 Wochen haben, um die Anzahl der Säuglinge zu begrenzen, die schwerwiegende Folgeerscheinungen einer Frühgeburt entwickeln und basierend auf den unten aufgeführten Kriterien nicht für diese Studie in Frage kommen würden. Eltern von eingeschriebenen Probanden erhalten für ihre Teilnahme einen Babies R Us-Geschenkgutschein im Wert von 50 USD. Die Probanden werden aus vier Neugeborenen-Intensivstationen rekrutiert, darunter 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], und 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] durch einen PI/Co-Investigator des Studienstandorts oder den Studienkoordinator für Neugeborene. Die Einverständniserklärung wird vor dem Eintritt der Teilnehmer in die Studie nach Rücksprache mit dem behandelnden Arzt und der/den Krankenschwester(n) eingeholt. Insgesamt 180 EPIs (ungefähr gleich viele Männer und Frauen, kein Ausschluss aufgrund von Rasse/ethnischer Zugehörigkeit) werden an der Studie teilnehmen (Stärke > 0,85, Fehler 1. Art < 0,05).

Ausschlusskriterien: EPIs werden nicht für diese Studie rekrutiert, wenn sie eine der folgenden Eigenschaften aufweisen: 1) chromosomale und angeborene Anomalien, einschließlich kraniofazialer Missbildungen, Anomalien des Nervensystems, zyanotische angeborene Herzerkrankungen, Gastroschisis, Omphalozele, Zwerchfellhernie und/oder andere schwere Magen-Darm-Erkrankungen Anomalien; 2) angeborene Infektion, 3) keine dokumentierte GA, 4) schwere IUGR (3 %), 5) abnormaler neurologischer Status einschließlich Kopfumfang < 10. oder > 90. Perzentil, intrakranielle Blutung Grad III und IV, Krampfanfälle, Meningitis, neurologische Untersuchung mit auffälligem Befund Tonus oder Bewegungen aller Extremitäten für PCA; 6) Vorgeschichte einer nekrotisierenden Enterokolitis (Stadium II und III); und 7) kulturpositive Sepsis zum Zeitpunkt der Studieneinschreibung.

Protokoll: EPIs werden zwischen zwei Gestationsaltersgruppen (24 0/7 - 26 6/7 Wochen und 27 0/7 - 28 6/7 Wochen) stratifiziert. Jedes Kind wird randomisiert, um entweder die PULSED NTrainer- oder die SHAM-Intervention zu erhalten, wobei eine ganzzahlige Zufallsfunktion der Software in Minitab v.17 (www.minitab.com) verwendet wird. Säuglinge, die der PULSED NTrainer-Gruppe zugeordnet sind, erhalten eine progressive Dosis der pulsatilen orokutanen Stimulation. Ab 30 Wochen PCA erhalten diese Säuglinge 2 Wochen lang eine niedrig dosierte PULSED NTrainer-Stimulation (2 x 3-Minuten-Blöcke) mit einer 1-minütigen Stimulations-„Aus-Periode“ zwischen den Stimulationsblöcken. Diese Form der Stimulation wird gleichzeitig mit der Sondenernährung dreimal täglich verabreicht. Die Stimulusdosis wird dann über die nächsten 2 Wochen erhöht (3 x 3-Minuten-Blöcke mit PULSED NTrainer-Stimulation) mit einer 1-minütigen Stimulus-„Off-Periode“ zwischen den Stimulationsblöcken, die ebenfalls gleichzeitig mit Sondenernährung 3-mal täglich verabreicht wird . EPIs, die in den SHAM-Zustand randomisiert wurden, erhalten während der Sondenernährung im gleichen Zeitraum einen normalen Silikonschnuller.

Zwischen den Stimulationsblöcken findet eine Ruhephase von 1 Minute (keine Stimulation) statt. Zu den Kriterien für den Beginn einer orokutanen Therapie gehören die folgenden: 1) stabile Vitalzeichen und keine kontinuierliche Vasopressormedikation; 2) Tolerierung enteraler Ernährung in den letzten 48 Stunden; und 3) nicht intubiert und mechanisch beatmet. Wenn der Säugling mit nasaler intermittierender positiver Druckbeatmung, kontinuierlichem positivem Atemwegsdruck oder einer Nasenkanüle > 2 Liter pro Minute versorgt wird, muss der FiO2 < 40 % sein.

NNS-Beurteilung und automatisierte digitale NNS-Signalverarbeitung und Merkmalsextraktion: Zusätzlich zu den oralen Stimulationsinterventionen (PULSED NTrainer vs. SHAM-Schnuller) werden alle Studienkinder dreimal pro Woche (z. B. M/W/F) auf NNS-Leistung untersucht . Das NTrainer-System wird im „Bewertungsmodus“ verwendet, um die Kompressionsdynamik von NNS während einer 3-minütigen Sitzung unmittelbar vor einer Sondenernährung aufzuzeichnen, die nicht mit einem Interventionszustand verbunden ist.

Die aktivste 2-Minuten-Periode des NNS-Verhaltens basierend auf der Anzahl der Saugzyklen wird automatisch aus jeder Saugbewertungsdatendatei extrahiert, indem ein automatischer Algorithmus zur Extraktion von Wellenformmerkmalen auf dem NTrainer-System verwendet wird. Druckspitzen > 1,6 cm H2O werden Merkmalsextraktionskriterien unterzogen, einschließlich Saugzyklussymmetrie, Zyklusdauer und Burst-Identifikation, definiert als zwei oder mehr NNS-Ereignisse, die innerhalb von 1200 ms auftreten. Dieser Algorithmus ermöglicht die objektive Identifizierung von NNS-Burst-Aktivität, die sich von Nicht-NNS-Mundkompressionen oder Zungenstößen gegen den Schnuller unterscheidet. Vier Messungen werden objektiv aus den indizierten Aufzeichnungen der Saugkompression extrahiert, einschließlich Minutenraten für (1) NNS-Bursts, bei denen ein einzelner Burst 2 oder mehr Saugzyklen umfasst, (2) NNS-Zyklusereignisse, die als Saugkompressionszyklen mit kürzeren Zyklusperioden definiert sind als 1200 ms, (3) Gesamte orale Kompressionen, definiert als die Summe aller Druckereignisse, und (4) NNS-Kompressionsdruck, ausgedrückt in cm H2O.

PO Feeding Advancement: EPIs werden nach einem standardisierten Cue-basierten Ernährungsplan vorangetrieben, der von jeder Standort-NICU verwendet wird, bekannt als Infant Driven Feeding®, der zu einer vollständigen Brustwarzenernährung führt. Diese Standardisierung der Fortschritte bei der oralen Ernährung über Standorte hinweg wird Störfaktoren begrenzen, die letztendlich die Daten verzerren können.

Speichelsammlung, -verarbeitung und Genexpressionsanalyse: Speichelsammlung: Speichelproben werden von allen angemeldeten Säuglingen am ersten Tag vor Erhalt der SHAM- oder PULSED NTrainer-Intervention gesammelt. Diese Probe dient als unser grundlegendes Genexpressionsprofil. Die Proben werden dann zweimal pro Woche (~ 3-Tages-Intervalle) bis zum Erreichen der vollständigen oralen Nahrungsaufnahme oder der Entlassung aus dem Krankenhaus mit entweder einer Magensonde (NG) oder einer Gastronomiesonde nach Hause entnommen.

Speichelproben werden an jedem Standort mit Techniken gesammelt, die vom Maron-Labor optimiert und validiert wurden. Kurz gesagt werden Speichelproben mit einer 1-ml-Spritze gesammelt, die Endkappen entfernt und an einer niedrigen Wandabsaugung befestigt. Speichel wird etwa 20 Sekunden lang gesammelt und sofort in 500 μl RNA Protect Saliva von Qiagen stabilisiert, um Änderungen der Genexpression zu stoppen, zerstörerische RNasen zu hemmen und mikrobielles Überwachsen zu begrenzen. Die Proben werden kurz gevortext und bei -20 °C eingefroren. Nach dem Einfrieren sind die Proben bis zu 18 Monate stabil, bevor eine vollständige RNA-Extraktion erforderlich ist. Daher werden Proben aus Nebraska und Santa Clara einmal im Monat auf Eis über Nacht zum Maron-Labor am Mother Infant Research Institute des Tufts Medical Center in Boston, MA, zur Verarbeitung versandt.

Erstellung einer Speichel-Biobank: Jede Woche wird eine zusätzliche Speichelprobe von allen eingeschriebenen Probanden entnommen, um ein Biobank-Repository zu erstellen. Indem wir jede Woche eine zusätzliche Stichprobe von Studienteilnehmern einlagern, wird sichergestellt, dass wir den Verlust von Datenpunkten begrenzen. Wir gehen davon aus, dass es aussagekräftige Speichel-Biomarker für die Reifung der oralen Nahrungsaufnahme gibt, die noch identifiziert werden müssen. Durch die Generierung einer Biobank zusätzlicher Speichelproben, die rückwirkend entweder auf einer Mikroarray-Genexpressionsplattform oder mit RNASeq abgefragt werden können, haben wir das Potenzial, neue Hypothesen über Gen-Gen-Interaktionen und/oder transkriptionelle Regulationsprozesse im Zusammenhang mit der oralen Fütterung zu entdecken EPI-Population.

Gesamt-RNA-Extraktion: Speichelproben werden auf Gesamt-RNA extrahiert, wobei etablierte Protokolle verwendet werden, die im Maron-Labor optimiert wurden. Die RNA-Extraktion erfolgt mit dem QIAGEN RNAProtect Saliva Mini-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für jede Probe wird eine DNase-Behandlung auf der Säule durchgeführt, um eine genomische DNA-Kontamination zu beseitigen. Proben, die Teil der Biobank sind, werden bei -80 °C eingefroren, bis sie für zukünftige Analysen benötigt werden. Proben, die für RT-qPCR-Experimente verwendet werden, werden zunächst gemäß den Anweisungen des Herstellers einer cDNA-Konvertierung mit dem Life Technologies SuperScript Vilo-Kit unterzogen. Die cDNA wird bis zur Genexpressionsanalyse bei -80 °C im Mother Infant Research Institute des Tufts Medical Center gelagert.

Genexpressionsanalyse: Für die Zwecke dieser Studie werden wir jede Probe auf neun Gene, sechs interessierende Zielgene und drei Referenzgene zur Qualitätskontrolle und möglichen Normalisierung von Genexpressionsdaten abfragen. Zu den in dieser Studie zu analysierenden Genen wurde zuvor gezeigt, dass sie in direktem Zusammenhang mit der oralen Ernährung des Neugeborenen stehen, darunter PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK und NPHP4. Die drei Referenzgene umfassen GAPDH, HPRT1 und YWHAZ, von denen sich gezeigt hat, dass sie bei fortschreitender PCA eine stabile Genexpression aufrechterhalten. Alle cDNA-Proben werden einer gezielten Voramplifikation mit einem kundenspezifischen TaqMan® PreAmp Master Mix für alle neun Gene unterzogen. Dieser gezielte Amplifikationsansatz stellt sicher, dass nur die interessierenden Gene amplifiziert werden und nicht alle Gene im gesamten Transkriptom, die zu Verzerrungen führen könnten. Die voramplifizierte cDNA wird dann einer PCR mit TaqMan Fast Advance Master Mix auf dem Real-Time-PCR-System Quant Studio 7 Flex von Life Technologies unterzogen. Dieses Instrument ist im Mother Infant Research Institute des Tufts Medical Center untergebracht und ist ein hochmodernes PCR-Gerät und Softwaresystem. Es werden alle Anstrengungen unternommen, um die Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Real-Time-PCR-Experimente (MIQE)-Richtlinien für diese Studie einzuhalten. Alle Proben werden doppelt mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen getestet.

Anfängliche Genexpressionsanalysen: Alle Genexpressionsdaten werden auf dem Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System normalisiert. Bei der Analyse werden nur Proben berücksichtigt, bei denen alle drei Referenzgene erfolgreich amplifiziert wurden. Früher waren Gene binär informativ (+/- Expression). Für die Zwecke dieser Studie werden wir jedoch bereit sein, die relative Genexpression jedes Zielgens mit der Delta-Delta-Zyklus-Schwellenwert-(ΔΔCt)-Methode zu berechnen. Gemäß den MIQE-Richtlinien werden wir die drei Referenzgene zur Normalisierung verwenden und ein geometrisches Mittel ihres Ct in jeder Probe bestimmen, um die relative Genexpression zu berechnen.

Neuroentwicklungs-Follow-up: Als Teil der Standardversorgung wird jeder Standort die Bayley-Skalen der Säuglings- und Kleinkindentwicklung, 3. Ausgabe, auf EPIs im korrigierten Alter (CA) von 18 bis 24 Monaten ausfüllen. Die wichtigsten Untertests von Interesse sind Feinmotorik, Grobmotorik, Kognition und Sprache. Diese Daten werden aufgezeichnet, analysiert und mit Fütterungsergebnissen in der neo- und postnatalen Phase, Genexpressionsdaten und Interventionsstatus korreliert. Zusätzlich werden Wachstumsparameter wie Kopfumfang, Länge und Gewicht erfasst.