Somatosensorisk modulering av spyttgenuttrykk og oral fôring hos premature spedbarn

Hensikten med denne studien er å kombinere molekylære og atferdsmessige metoder i en eksperimentell konseptualiseringstilnærming for å kartlegge effekten av trigeminal (PULSED orokutan) somatosensorisk stimulering på spyttgenuttrykk i sammenheng med tilegnelsen av en utsøkt kompleks oromotorisk ferdighet, nemlig oral fôring, hos nyfødte med høy risiko. Målet med denne studien representerer det første forsøket på å kombinere ikke-invasive behandlingsstrategier og transkriptomiske vurderinger av høyrisiko EPIer for å (1) forbedre oral fôringsatferd og ferdigheter, (2) fremme vår forståelse av genontologien til biologisk mangfoldige veier relatert. til oral fôring, (3) bruke genuttrykksdata for å tilpasse neonatal omsorg og individualisere behandlingsstrategier og timing av intervensjoner, og (4) forbedre langsiktige utviklingsresultater. Denne integrerte tilnærmingen til oral fôring er et paradigmeskifte i neonatal omsorg der raskt nye teknologiske fremskritt og personlig transkriptomikk kan trygt og ikke-invasivt bringes til neonatal sengen for å informere medisinske behandlingsbeslutninger og forbedre omsorg og resultater.

Metoder Deltakere: Bare EPIer født mellom 24 0/7 og 28 6/7 ukers svangerskap, bestemt ved obstetrisk ultralyd ved < 15 uker eller siste menstruasjon, er kvalifisert til å delta i denne studien. Vi vil aktivt registrere EPI-er når de har en korrigert PCA på ≥ 29 uker for å begrense antallet spedbarn som utvikler alvorlige følgetilstander etter prematuritet og ikke vil være kvalifisert for denne studien basert på kriteriene oppført nedenfor. Foreldre til påmeldte fag vil motta et Babies R Us-gavekort på $50 for deltakelse. Forsøkspersoner vil bli rekruttert fra fire intensivavdelinger for nyfødte, inkludert 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], og 4) Children's Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] av en PI/Co-Investigator eller koordinator for neonatalstudiet. Informert samtykke vil bli innhentet før deltakerne går inn i studien, etter konsultasjon med behandlende lege og sykepleier(e). Totalt 180 EPI-er (omtrent like mange menn og kvinner, ingen ekskludering basert på rase/etnisitet) vil delta i studien (styrke >.85, Type I-feil <.05).

Eksklusjonskriterier: EPIer vil ikke bli rekruttert til denne studien hvis de har noen av følgende: 1) kromosomale og medfødte anomalier inkludert kraniofacial misdannelse, nervesystemanomalier, cyanotisk medfødt hjertesykdom, gastroschisis, omphalocele, diafragmatisk brokk og/eller andre store gastrointestinale sykdommer anomalier; 2) medfødt infeksjon, 3) ingen dokumentert GA, 4) alvorlig IUGR (3%), 5) unormal nevrologisk status inkludert hodeomkrets < 10. eller > 90. persentil, intrakraniell blødning grad III og IV, anfall, meningitt, nevrologisk undersøkelse som viser unormal tonus eller bevegelser av alle ekstremiteter for PCA; 6) historie med nekrotiserende enterokolitt (stadium II og III); og, 7) kulturpositiv sepsis på tidspunktet for studieregistrering.

Protokoll: EPIer vil bli stratifisert i to svangerskapsaldersgrupper (24 0/7 - 26 6/7 uker, og 27 0/7 - 28 6/7 uker). Hvert spedbarn vil bli randomisert til å motta enten PULSED NTrainer- eller SHAM-intervensjonen ved å bruke en programvare tilfeldig heltallsfunksjon i Minitab v.17 (www.minitab.com). Spedbarn som er tilordnet PULSED NTrainer-gruppen vil motta en progressiv dose av den pulserende orokutane stimuleringen. Fra og med 30 ukers PCA, vil disse spedbarnene motta 2 uker med lavdose PULSED NTrainer-stimulering (2 x 3-minutters blokker) med en 1-minutters stimulus 'off-periode' mellom stimuleringsblokkene. Denne formen for stimulering vil gis samtidig med sondeernæring 3 ganger/dag. Stimulusdosen vil deretter økes i løpet av de neste 2 ukene (3 x 3-minutters blokker med PULSED NTrainer-stimulering) med en 1-minutters stimulus 'off-periode' mellom stimuleringsblokkene, også gitt samtidig med sondeernæring 3 ganger/dag . EPI-er randomisert til SHAM-tilstanden vil få en vanlig silikonsmokk under sondemating over samme tidsperiode.

En 1-minutters hvileperiode (ingen stimulering) skjer mellom stimuleringsblokkene. Kriterier for initiering av orokutan terapi inkluderer følgende: 1) stabile vitale tegn og ikke på kontinuerlige vasopressormedisiner; 2) tolerere enteral mat i de foregående 48 timer; og 3) ikke intuberet og mekanisk ventilert. Hvis spedbarnet er på nese intermitterende positivt trykkventilasjon, kontinuerlig positivt luftveistrykk eller nesekanyle >2 liter per minutt, må FiO2 være <40 %.

NNS Assessment og Automated NNS Digital Signal Processing and Feature Extraction: I tillegg til de orale stimuleringsintervensjonene (PULSED NTrainer vs. SHAM smokk), vil alle studiespedbarn bli vurdert 3 ganger i uken (f.eks. M/W/F) for NNS-ytelse . NTrainer-systemet vil bli brukt i "vurderingsmodus" for å registrere kompresjonsdynamikken til NNS i løpet av en 3-minutters økt for umiddelbart å gå foran en sondeernæring som ikke er assosiert med en intervensjonstilstand.

Den mest aktive 2-minutters perioden med NNS-atferd basert på antall sugesykluser trekkes automatisk ut fra hver sugevurderingsdatafil ved hjelp av en automatisk utvinningsalgoritme for kurvefunksjoner på NTrainer-systemet. Trykktopper > 1,6 cm H2O utsettes for funksjonsekstraksjonskriterier, inkludert sugesyklussymmetri, syklusvarighet og burstidentifikasjon definert som to eller flere NNS-hendelser som inntreffer innen 1200 ms. Denne algoritmen tillater objektiv identifikasjon av NNS-burst-aktivitet forskjellig fra ikke-NNS-munnkompresjoner eller tungestøt mot smokken. Fire mål vil bli objektivt hentet ut fra de indekserte registreringene av sugekompresjon, inkludert minutthastigheter for (1) NNS Bursts der en individuell burst inkluderer 2 eller flere sugesykluser, (2) NNS Cycle Events definert som sugekompresjonssykluser med syklusperioder mindre enn 1200 ms, (3) Totale orale kompresjoner definert som summen av alle trykkhendelser, og (4) NNS-kompresjonstrykk uttrykt i cm H2O.

Fremskritt i PO-fôring: EPI-er vil gå videre med en standardisert cue-basert fôringsplan som brukes av hver NICU på stedet, kjent som Infant Driven Feeding® som vil føre til full mating av brystvorten. Denne standardiseringen av muntlige fôringsfremskritt på tvers av nettsteder vil begrense konfoundere som til slutt kan skjeve dataene.

Spyttinnsamling, prosessering og genekspresjonsanalyse: Spyttinnsamling: Spyttprøver vil bli samlet inn fra alle registrerte spedbarn den første dagen før de mottar enten SHAM- eller PULSED NTrainer-intervensjonen. Denne prøven vil tjene som vår baseline-genekspresjonsprofil. Prøver vil deretter bli tatt to ganger per uke (~ 3 dagers intervaller) frem til tidspunktet for oppnåelse av full oral mating eller utskrivning hjem fra sykehuset med enten en nasogastrisk sonde (NG) eller gastronomisonde.

Spyttprøver på hvert sted vil bli samlet inn med teknikker som er optimert og validert gjennom Maron-laboratoriet. Kort fortalt vil spyttprøver tas med en 1 mL sprøyte, endelokkene fjernes og festes til lavveggssug. Spytt vil bli samlet i omtrent 20 sekunder og umiddelbart stabilisert i 500 μL av Qiagens RNA Protect Saliva for å stoppe genuttrykksendringer, hemme destruktive RNaser og begrense mikrobiell overvekst. Prøver vil bli vortexet kort og frosset ved -20 grader C. Når de er frosset, er prøvene stabile i opptil 18 måneder før behov for total RNA-ekstraksjon. Dermed vil prøver fra Nebraska og Santa Clara bli sendt en gang i måneden på is over natten til Maron-laboratoriet ved Mother Infant Research Institute ved Tufts Medical Center i Boston, MA for behandling.

Generering av en spyttbiobank: En ekstra spyttprøve vil bli innhentet hver uke fra alle påmeldte forsøkspersoner for å generere et biobankdepot. Banking av en ekstra prøve hver uke fra studieobjekter vil sikre at vi begrenser tap av datapunkter. Vi forventer at det er informative spyttbiomarkører for oral fôringsmodning som ennå ikke er identifisert. Ved å generere en biobank av ytterligere spyttprøver som kan avhøres i ettertid på enten en mikroarray-genekspresjonsplattform eller med RNASeq, vil vi ha potensial til å oppdage nye hypoteser om gen-gen-interaksjoner og/eller transkripsjonelle reguleringsprosesser relatert til oral fôring i EPI-populasjon.

Total RNA-ekstraksjon: Spyttprøver vil ekstraheres for totalt RNA ved bruk av etablerte protokoller optimalisert i Maron-laboratoriet. RNA-ekstraksjon vil skje med QIAGEN RNAProtect Saliva Mini-settet i henhold til produsentens instruksjoner. På kolonnen vil DNase-behandling bli utført for hver prøve for å eliminere genomisk DNA-kontaminering. Prøver som inngår i biobanken vil fryses ved -80°C i påvente av behov for fremtidig analyse. Prøver som skal brukes til RT-qPCR-eksperimenter vil først gjennomgå cDNA-konvertering med Life Technologies SuperScript Vilo-settet i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA vil bli lagret ved -80 °C i Mother Infant Research Institute ved Tufts Medical Center i påvente av genekspresjonsanalyse.

Genekspresjonsanalyse: For formålet med denne studien vil vi undersøke hver prøve for ni gener, seks målgener av interesse og tre referansegener for kvalitetskontroll og potensiell normalisering av genekspresjonsdata. Gener som skal analyseres i denne studien har tidligere vist seg å være direkte knyttet til oral fôring hos nyfødte og inkluderer PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK og NPHP4. De tre referansegenene inkluderer GAPDH, HPRT1 og YWHAZ, som alle har vist seg å opprettholde stabilt genuttrykk på tvers av fremadskridende PCA. Alle cDNA-prøver vil gjennomgå en målrettet pre-amplifisering med en tilpasset TaqMan® PreAmp Master Mix for alle ni gener. Denne målrettede tilnærmingen til amplifikasjon vil sikre at bare de genene av interesse vil bli amplifisert og ikke alle gener på tvers av transkriptomet som kan introdusere skjevhet. Forforsterket cDNA vil deretter gjennomgå PCR med TaqMan Fast Advance Master Mix på Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Dette instrumentet er plassert hos Mother Infant Research Institute ved Tufts Medical Center og er en avansert, toppmoderne PCR-maskin og programvaresystem. Alle anstrengelser vil bli gjort for å overholde retningslinjene for minimumsinformasjon for publisering av kvantitative sanntids PCR-eksperimenter (MIQE) for denne studien. Alle prøver vil bli kjørt i duplikat med passende positive og negative kontroller.

Innledende genekspresjonsanalyser: Alle genekspresjonsdata vil bli normalisert på Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Kun prøver som har vellykket amplifisering av alle tre referansegenene vil bli vurdert i analysen. Tidligere har gener vært informative på en binær måte (+/- uttrykk). For formålet med denne studien vil vi imidlertid være forberedt på å beregne relativ genuttrykk for hvert målgen med delta delta syklusterskel (ΔΔCt) metoden. I samsvar med MIQE-retningslinjene vil vi bruke de tre referansegenene for normalisering og bestemme et geometrisk gjennomsnitt av deres Ct i hver prøve for å beregne relativ genuttrykk.

Nevroutviklingsoppfølging: Som en del av standardbehandlingen vil hvert nettsted fullføre Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Edition, på EPIer ved 18 til 24 måneders korrigert alder (CA). De primære deltestene av interesse inkluderer finmotorikk, grovmotorikk, kognisjon og språk. Disse dataene vil bli registrert, analysert og korrelert med fôringsresultater i neo- og postnatale perioden, genekspresjonsdata og intervensjonsstatus. I tillegg vil vekstparametere inkludert hodeomkrets, lengde og vekt bli registrert.