Modulazione somatosensoriale dell'espressione genica salivare e alimentazione orale nei neonati prematuri

Lo scopo di questo studio è combinare metodi molecolari e comportamentali in un approccio di concettualizzazione sperimentale per mappare gli effetti della stimolazione somatosensoriale del trigemino (PULSED orocutaneo) sull'espressione genica salivare nel contesto dell'acquisizione di un'abilità oromotoria squisitamente complessa, vale a dire l'alimentazione orale, nei neonati umani ad alto rischio. Gli obiettivi di questo studio rappresentano il primo tentativo di combinare strategie di trattamento non invasive e valutazioni trascrittomiche di EPI ad alto rischio per (1) migliorare il comportamento e le capacità di alimentazione orale, (2) approfondire la nostra comprensione dell'ontologia genica di percorsi biologicamente diversi correlati all'alimentazione orale, (3) utilizzare i dati di espressione genica per personalizzare l'assistenza neonatale e individualizzare le strategie di trattamento e gli interventi di temporizzazione e (4) migliorare i risultati dello sviluppo a lungo termine. Questo approccio integrativo all'alimentazione orale è un cambio di paradigma nell'assistenza neonatale in cui i progressi tecnologici rapidamente emergenti e la trascrittomica personalizzata possono essere portati in modo sicuro e non invasivo al capezzale neonatale per informare le decisioni di assistenza medica e migliorare l'assistenza e i risultati.

Metodi Partecipanti: Solo gli EPI nati tra la 24 0/7 e la 28 6/7 settimana di gestazione, come determinato dall'ecografia ostetrica a < 15 settimane o dall'ultimo periodo mestruale, sono idonei a partecipare a questo studio. Arruolaremo attivamente gli EPI una volta che avranno un PCA corretto di ≥ 29 settimane per limitare il numero di neonati che sviluppano gravi sequele di prematurità e non sarebbero idonei per questo studio in base ai criteri elencati di seguito. I genitori dei soggetti iscritti riceveranno una carta regalo Babies R Us $ 50 per la loro partecipazione. I soggetti saranno reclutati da quattro unità di terapia intensiva neonatale tra cui 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], e 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] da un PI/co-investigatore del centro di studio o dal coordinatore dello studio neonatale. Il consenso informato sarà ottenuto prima dell'ingresso dei partecipanti nello studio, previa consultazione con il medico curante e l'infermiere/i. Parteciperanno allo studio un totale di 180 EPI (numero approssimativamente uguale di maschi e femmine, nessuna esclusione basata su razza/etnia) (potenza >.85, errore di tipo I <.05).

Criteri di esclusione: gli EPI non saranno reclutati per questo studio se presentano una delle seguenti condizioni: 1) anomalie cromosomiche e congenite tra cui malformazione craniofacciale, anomalie del sistema nervoso, cardiopatia congenita cianotica, gastroschisi, onfalocele, ernia diaframmatica e/o altri disturbi gastrointestinali importanti anomalie; 2) infezione congenita, 3) GA non documentato, 4) IUGR grave (3%), 5) stato neurologico anormale inclusa circonferenza cranica < 10° o > 90° percentile, emorragia intracranica di grado III e IV, convulsioni, meningite, esame neurologico che mostra anomalie tono o movimenti di tutte le estremità per PCA; 6) storia di enterocolite necrotizzante (stadio II e III); e, 7) sepsi positiva alla coltura al momento dell'iscrizione allo studio.

Protocollo: gli EPI saranno stratificati tra due gruppi di età gestazionale (24 0/7 - 26 6/7 settimane e 27 0/7 - 28 6/7 settimane). Ogni bambino verrà randomizzato per ricevere l'intervento PULSED NTrainer o SHAM utilizzando una funzione intera casuale del software in Minitab v.17 (www.minitab.com). I neonati assegnati al gruppo PULSED NTrainer riceveranno una dose progressiva della stimolazione pulsatile orocutanea. A partire da 30 settimane di PCA, questi neonati riceveranno 2 settimane di stimolazione PULSED NTrainer a basso dosaggio (2 blocchi da 3 minuti) con un "periodo di pausa" dello stimolo di 1 minuto tra i blocchi di stimolazione. Questa forma di stimolazione verrà somministrata contemporaneamente all'alimentazione tramite sondino 3 volte al giorno. La dose di stimolo verrà quindi aumentata nelle 2 settimane successive (3 blocchi da 3 minuti di stimolazione PULSED NTrainer) con un "periodo di pausa" dello stimolo di 1 minuto tra i blocchi di stimolazione, anch'essi somministrati simultaneamente con l'alimentazione tramite sondino 3 volte al giorno . Gli EPI randomizzati alla condizione SHAM riceveranno un normale ciuccio in silicone durante l'alimentazione tramite sondino nello stesso periodo di tempo.

Tra i blocchi di stimolazione si verifica un periodo di riposo di 1 minuto (nessuna stimolazione). I criteri per l'inizio della terapia orocutanea includono quanto segue: 1) segni vitali stabili e non su farmaci vasopressori continui; 2) tollerare l'alimentazione enterale nelle 48 ore precedenti; e 3) non intubato e ventilato meccanicamente. Se il neonato è sottoposto a ventilazione nasale a pressione positiva intermittente, pressione positiva continua delle vie aeree o cannula nasale >2 litri al minuto, la FiO2 deve essere <40%.

Valutazione NNS ed elaborazione automatizzata del segnale digitale NNS ed estrazione delle caratteristiche: oltre agli interventi di stimolazione orale (PULSED NTrainer vs. ciuccio SHAM), tutti i neonati dello studio saranno valutati 3 volte a settimana (ad esempio, M/W/F) per le prestazioni NNS . Il sistema NTrainer verrà utilizzato in "modalità di valutazione" per registrare le dinamiche di compressione di NNS durante una sessione di 3 minuti per precedere immediatamente un'alimentazione con sondino non associata a una condizione di intervento.

Il periodo di 2 minuti più attivo del comportamento NNS basato sul conteggio del ciclo di suzione viene estratto automaticamente da ciascun file di dati di valutazione della suzione utilizzando un algoritmo di estrazione automatica delle caratteristiche della forma d'onda sul sistema NTrainer. I picchi di pressione > 1,6 cm H2O sono soggetti a criteri di estrazione delle caratteristiche, tra cui la simmetria del ciclo di suzione, la durata del ciclo e l'identificazione del burst definiti come due o più eventi NNS che si verificano entro 1200 ms. Questo algoritmo consente l'identificazione obiettiva dell'attività burst NNS distinta dalle compressioni della bocca non NNS o dalle spinte della lingua contro il ciuccio. Quattro misure saranno obiettivamente estratte dai record indicizzati della compressione dell'aspirazione, comprese le frequenze al minuto per (1) Burst NNS in cui un singolo burst include 2 o più cicli di aspirazione, (2) Eventi del ciclo NNS definiti come cicli di compressione dell'aspirazione con periodi di ciclo inferiori superiore a 1200 ms, (3) compressioni orali totali definite come la somma di tutti gli eventi di pressione e (4) pressione di compressione NNS espressa in cm H2O.

Avanzamento dell'alimentazione PO: gli EPI avanzeranno in base a un programma di alimentazione standardizzato basato su segnali utilizzato da ciascuna UTIN del sito, noto come Infant Driven Feeding® che porterà a un'alimentazione completa del capezzolo. Questa standardizzazione dei progressi dell'alimentazione orale tra i siti limiterà i fattori confondenti che potrebbero alla fine distorcere i dati.

Raccolta della saliva, elaborazione e analisi dell'espressione genica: Raccolta della saliva: i campioni di saliva verranno raccolti da tutti i neonati arruolati il ​​primo giorno prima di ricevere l'intervento SHAM o PULSED NTrainer. Questo campione servirà come profilo di espressione genica di base. I campioni verranno quindi prelevati due volte a settimana (intervalli di ~ 3 giorni) fino al momento del raggiungimento di un'alimentazione orale completa o della dimissione a casa dall'ospedale con un sondino nasogastrico (NG) o sondino gastronomico.

I campioni di saliva in ogni sito saranno raccolti con tecniche che sono state ottimizzate e validate attraverso il laboratorio Maron. In breve, i campioni di saliva saranno raccolti con una siringa da 1 mL, i cappucci terminali rimossi e attaccati all'aspirazione a parete bassa. La saliva verrà raccolta per circa 20 secondi e immediatamente stabilizzata in 500 μL di RNA Protect Saliva di Qiagen per arrestare i cambiamenti di espressione genica, inibire le RNasi distruttive e limitare la crescita eccessiva microbica. I campioni saranno vortexati brevemente e congelati a -20 gradi C. Una volta congelati, i campioni sono stabili fino a 18 mesi prima della necessità dell'estrazione totale dell'RNA. Pertanto, i campioni dal Nebraska e Santa Clara verranno spediti una volta al mese su ghiaccio durante la notte al laboratorio Maron presso il Mother Infant Research Institute presso il Tufts Medical Center di Boston, MA per l'elaborazione.

Generazione di una biobanca di saliva: ogni settimana verrà prelevato un ulteriore campione di saliva da tutti i soggetti iscritti per generare un archivio di biobanca. Depositare un campione aggiuntivo ogni settimana dai soggetti dello studio garantirà la limitazione della perdita di punti dati. Prevediamo che esistono biomarcatori salivari informativi della maturazione dell'alimentazione orale che devono ancora essere identificati. Generando una biobanca di ulteriori campioni di saliva che possono essere interrogati retrospettivamente su una piattaforma di espressione genica di microarray o con RNASeq, avremo il potenziale per scoprire nuove ipotesi sulle interazioni gene-gene e/o sui processi di regolazione trascrizionale relativi all'alimentazione orale nel Popolazione EPI.

Estrazione totale dell'RNA: i campioni salivari verranno estratti per l'RNA totale utilizzando protocolli stabiliti ottimizzati nel laboratorio Maron. L'estrazione dell'RNA avverrà con il kit QIAGEN RNAProtect Saliva Mini secondo le istruzioni del produttore. Sulla colonna verrà eseguito il trattamento con DNasi per ogni campione per eliminare la contaminazione del DNA genomico. I campioni che fanno parte della biobanca saranno congelati a -80°C in attesa di analisi future. I campioni che verranno utilizzati per gli esperimenti RT-qPCR saranno prima sottoposti a conversione del cDNA con il kit Life Technologies SuperScript Vilo secondo le istruzioni del produttore. Il cDNA sarà conservato a -80°C nel Mother Infant Research Institute del Tufts Medical Center in attesa dell'analisi dell'espressione genica.

Analisi dell'espressione genica: Ai fini di questo studio, interrogheremo ogni campione per nove geni, sei geni bersaglio di interesse e tre geni di riferimento per il controllo di qualità e la potenziale normalizzazione dei dati di espressione genica. I geni da analizzare in questo studio hanno precedentemente dimostrato di essere direttamente collegati all'alimentazione orale nel neonato e includono PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK e NPHP4. I tre geni di riferimento includono GAPDH, HPRT1 e YWHAZ, che hanno tutti dimostrato di mantenere un'espressione genica stabile durante l'avanzamento del PCA. Tutti i campioni di cDNA saranno sottoposti a una pre-amplificazione mirata con un Master Mix TaqMan® PreAmp personalizzato per tutti e nove i geni. Questo approccio mirato all'amplificazione assicurerà che solo i geni di interesse vengano amplificati e non tutti i geni attraverso il trascrittoma che potrebbero introdurre bias. Il cDNA preamplificato sarà quindi sottoposto a PCR con TaqMan Fast Advance Master Mix sul sistema PCR in tempo reale Quant Studio 7 Flex di Life Technologies. Questo strumento è ospitato presso il Mother Infant Research Institute presso il Tufts Medical Center ed è una macchina PCR e un sistema software all'avanguardia. Verranno compiuti tutti gli sforzi per aderire alle linee guida MIQE (Minime Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) per questo studio. Tutti i campioni verranno analizzati in duplicato con controlli positivi e negativi appropriati.

Analisi iniziali dell'espressione genica: tutti i dati sull'espressione genica saranno normalizzati sul sistema Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR. Nell'analisi saranno presi in considerazione solo i campioni che hanno amplificato con successo tutti e tre i geni di riferimento. In precedenza, i geni erano informativi in ​​modo binario (+/- espressione). Tuttavia, ai fini di questo studio, saremo preparati a calcolare l'espressione genica relativa di ciascun gene bersaglio con il metodo delta delta cycle threshold (ΔΔCt). In accordo con le linee guida del MIQE, utilizzeremo i tre geni di riferimento per la normalizzazione e determineremo una media geometrica del loro Ct in ciascun campione per calcolare l'espressione genica relativa.

Follow-up dello sviluppo neurologico: come parte dello standard di cura, ogni centro completerà la terza edizione della Bayley Scales of Infant and Toddler Development, sugli EPI a 18-24 mesi di età corretta (CA). I principali sottotest di interesse includono Motoria fine, Motoria grossolana, Cognizione e Linguaggio. Questi dati saranno registrati, analizzati e correlati con gli esiti dell'alimentazione nel periodo neo e postnatale, i dati di espressione genica e lo stato dell'intervento. Inoltre, verranno registrati i parametri di crescita tra cui circonferenza della testa, lunghezza e peso.