Modulación somatosensorial de la expresión génica salival y alimentación oral en lactantes prematuros

El propósito de este estudio es combinar métodos moleculares y conductuales en un enfoque de conceptualización experimental para mapear los efectos de la estimulación somatosensorial trigeminal (pulsada orocutánea) sobre la expresión génica salival en el contexto de la adquisición de una habilidad oromotora exquisitamente compleja, a saber, alimentación oral, en recién nacidos humanos de alto riesgo. Los objetivos de este estudio representan el primer intento de combinar estrategias de tratamiento no invasivas y evaluaciones transcriptómicas de EPI de alto riesgo para (1) mejorar el comportamiento y las habilidades de alimentación oral, (2) aumentar nuestra comprensión de la ontología genética de vías biológicamente diversas relacionadas a la alimentación oral, (3) utilizar datos de expresión génica para personalizar la atención neonatal e individualizar las estrategias de tratamiento y las intervenciones de sincronización, y (4) mejorar los resultados de desarrollo a largo plazo. Este enfoque integrador de la alimentación oral es un cambio de paradigma en la atención neonatal, donde los rápidos avances tecnológicos y la transcriptómica personalizada pueden llevarse de forma segura y no invasiva a la cabecera neonatal para informar las decisiones de atención médica y mejorar la atención y los resultados.

Métodos Participantes: Solo los EPI nacidos entre las 24 0/7 y las 28 6/7 semanas de gestación, según lo determinado por ultrasonido obstétrico en < 15 semanas o último período menstrual, son elegibles para participar en este estudio. Inscribiremos activamente a los EPI una vez que tengan un PCA corregido de ≥ 29 semanas para limitar la cantidad de bebés que desarrollan secuelas graves de prematuridad y no serían elegibles para este estudio según los criterios que se enumeran a continuación. Los padres de los sujetos inscritos recibirán una tarjeta de regalo de $50 de Babies R Us por su participación. Los sujetos serán reclutados de cuatro unidades de cuidados intensivos neonatales que incluyen 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], y 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Ángeles, CA] por un PI/Co-Investigador del sitio de estudio o el coordinador del estudio neonatal. Se obtendrá el consentimiento informado antes de que los participantes ingresen al estudio, luego de consultar con el médico y la enfermera a cargo. Un total de 180 EPI (aproximadamente el mismo número de hombres y mujeres, sin exclusión basada en la raza/etnicidad) participarán en el estudio (potencia > 0,85, error tipo I < 0,05).

Criterios de exclusión: los EPI no serán reclutados para este estudio si presentan alguno de los siguientes: 1) anomalías cromosómicas y congénitas, incluidas malformaciones craneofaciales, anomalías del sistema nervioso, cardiopatía congénita cianótica, gastrosquisis, onfalocele, hernia diafragmática y/u otras anomalías gastrointestinales importantes anomalías; 2) infección congénita, 3) AG no documentada, 4) RCIU grave (3%), 5) estado neurológico anormal que incluye perímetro cefálico < percentil 10 o > 90, hemorragia intracraneal grados III y IV, convulsiones, meningitis, examen neurológico que muestra anomalías tono o movimientos de todas las extremidades para PCA; 6) antecedentes de enterocolitis necrotizante (estadio II y III); y 7) sepsis con cultivo positivo en el momento de la inscripción en el estudio.

Protocolo: los EPI se estratificarán en dos grupos de edad gestacional (24 0/7 - 26 6/7 semanas y 27 0/7 - 28 6/7 semanas). Cada bebé será aleatorizado para recibir la intervención PULSED NTrainer o SHAM utilizando una función de número entero aleatorio de software en Minitab v.17 (www.minitab.com). Los bebés asignados al grupo PULSED NTrainer recibirán una dosis progresiva de estimulación orocutánea pulsátil. A partir de las 30 semanas de PCA, estos bebés recibirán 2 semanas de estimulación NTrainer PULSADA en dosis bajas (2 bloques de 3 minutos) con un "período de descanso" de estímulo de 1 minuto entre los bloques de estimulación. Esta forma de estimulación se administrará simultáneamente con la alimentación por sonda 3 veces al día. La dosis de estímulo luego se incrementará durante las próximas 2 semanas (3 bloques de 3 minutos de estimulación con NTrainer PULSADO) con un 'período de descanso' de estímulo de 1 minuto entre los bloques de estimulación, también administrado simultáneamente con alimentación por sonda 3 veces al día. . A los EPI asignados al azar a la condición SHAM se les dará un chupete regular de silicona durante la alimentación por sonda durante el mismo período de tiempo.

Se produce un período de descanso de 1 minuto (sin estimulación) entre bloques de estimulación. Los criterios para el inicio de la terapia orocutánea incluyen los siguientes: 1) signos vitales estables y sin medicación vasopresora continua; 2) tolerar alimentación enteral en las 48 horas previas; y 3) no intubados y ventilados mecánicamente. Si el bebé está en ventilación con presión positiva intermitente nasal, presión positiva continua en las vías respiratorias o cánula nasal >2 litros por minuto, entonces la FiO2 debe ser <40%.

Evaluación NNS y procesamiento de señal digital NNS automatizado y extracción de características: además de las intervenciones de estimulación oral (NPRAINE PULSADO versus chupete SHAM), todos los bebés del estudio serán evaluados 3 veces por semana (p. ej., M/W/F) para el rendimiento NNS . El sistema NTrainer se utilizará en el "modo de evaluación" para registrar la dinámica de compresión de NNS durante una sesión de 3 minutos para preceder inmediatamente a una alimentación por sonda que no esté asociada con una condición de intervención.

El período de 2 minutos más activo del comportamiento de NNS basado en el recuento de ciclos de succión se extrae automáticamente de cada archivo de datos de evaluación de succión mediante un algoritmo de extracción de características de forma de onda automatizado en el sistema NTrainer. Los picos de presión > 1,6 cm H2O están sujetos a criterios de extracción de características, incluida la simetría del ciclo de succión, la duración del ciclo y la identificación de ráfagas definidas como dos o más eventos NNS que ocurren dentro de 1200 ms. Este algoritmo permite la identificación objetiva de la actividad de estallido de NNS distinta de las compresiones con la boca que no son de NNS o los empujes de la lengua contra el chupete. Se extraerán objetivamente cuatro medidas de los registros indexados de compresión de succión, incluidas las tasas por minuto para (1) Ráfagas NNS donde una ráfaga individual incluye 2 o más ciclos de succión, (2) Eventos de ciclo NNS definidos como ciclos de compresión de succión con períodos de ciclo menores de 1200 ms, (3) compresiones orales totales definidas como la suma de todos los eventos de presión y (4) presión de compresión NNS expresada en cm H2O.

Avance de alimentación PO: los EPI avanzarán en un programa de alimentación estandarizado basado en señales utilizado por cada NICU del sitio, conocido como Infant Driven Feeding® que conducirá a alimentaciones completas del pezón. Esta estandarización de los avances en alimentación oral en todos los sitios limitará los factores de confusión que, en última instancia, pueden sesgar los datos.

Recolección de saliva, procesamiento y análisis de expresión génica: Recolección de saliva: Se recolectarán muestras de saliva de todos los bebés inscritos el primer día antes de recibir la intervención SHAM o PULSED NTrainer. Esta muestra servirá como nuestro perfil de expresión génica de referencia. Luego, se obtendrán muestras dos veces por semana (intervalos de ~ 3 días) hasta el momento de lograr la alimentación oral completa o el alta del hospital con una sonda nasogástrica (NG) o una sonda gastronómica.

Las muestras de saliva en cada sitio se recolectarán con técnicas que han sido optimizadas y validadas a través del laboratorio Maron. Brevemente, las muestras de saliva se recolectarán con una jeringa de 1 ml, se quitarán las tapas de los extremos y se conectarán a una succión de pared baja. La saliva se recolectará durante aproximadamente 20 segundos y se estabilizará inmediatamente en 500 μL de RNA Protect Saliva de Qiagen para detener los cambios en la expresión génica, inhibir las RNasas destructivas y limitar el crecimiento microbiano excesivo. Las muestras se agitarán brevemente y se congelarán a -20 °C. Una vez congeladas, las muestras son estables hasta 18 meses antes de que sea necesario extraer el ARN total. Por lo tanto, las muestras de Nebraska y Santa Clara se enviarán una vez al mes en hielo durante la noche al laboratorio Maron en el Instituto de Investigación Materno Infantil en el Centro Médico Tufts en Boston, MA para su procesamiento.

Generación de un Biobanco de Saliva: Se obtendrá una muestra de saliva adicional cada semana de todos los sujetos inscritos para generar un repositorio de biobanco. Almacenar una muestra adicional cada semana de los sujetos del estudio asegurará que limitaremos la pérdida de puntos de datos. Anticipamos que existen biomarcadores salivales informativos de la maduración de la alimentación oral que aún no se han identificado. Al generar un biobanco de muestras de saliva adicionales que pueden interrogarse retrospectivamente en una plataforma de expresión génica de micromatrices o con RNASeq, tendremos el potencial de descubrir nuevas hipótesis sobre interacciones gen-gen y/o procesos reguladores de la transcripción relacionados con la alimentación oral en el población del PAI.

Extracción de ARN total: las muestras de saliva se extraerán para determinar el ARN total mediante protocolos establecidos y optimizados en el laboratorio de Maron. La extracción de ARN se realizará con el kit QIAGEN RNAProtect Saliva Mini según las instrucciones del fabricante. En la columna, se realizará un tratamiento con ADNasa para cada muestra para eliminar la contaminación por ADN genómico. Las muestras que forman parte del biobanco se congelarán a -80 °C en espera de la necesidad de análisis futuros. Las muestras que se utilizarán para los experimentos de RT-qPCR se someterán primero a la conversión de cDNA con el kit SuperScript Vilo de Life Technologies según las instrucciones del fabricante. El ADNc se almacenará a -80 °C en el Instituto de Investigación Materno Infantil del Centro Médico Tufts en espera del análisis de la expresión génica.

Análisis de expresión génica: para los fines de este estudio, interrogaremos cada muestra en busca de nueve genes, seis genes diana de interés y tres genes de referencia para el control de calidad y la normalización potencial de los datos de expresión génica. Se ha demostrado previamente que los genes que se analizarán en este estudio están directamente relacionados con la alimentación oral en el recién nacido e incluyen PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK y NPHP4. Los tres genes de referencia incluyen GAPDH, HPRT1 y YWHAZ, todos los cuales han demostrado mantener una expresión génica estable a lo largo de PCA avanzada. Todas las muestras de ADNc se someterán a una preamplificación específica con una mezcla maestra TaqMan® PreAmp personalizada para los nueve genes. Este enfoque dirigido a la amplificación garantizará que solo se amplifiquen los genes de interés y no todos los genes del transcriptoma que pueden introducir sesgos. El ADNc preamplificado luego se someterá a una PCR con TaqMan Fast Advance Master Mix en el sistema de PCR en tiempo real Quant Studio 7 Flex de Life Technologies. Este instrumento se encuentra en el Mother Infant Research Institute en Tufts Medical Center y es una máquina de PCR y un sistema de software avanzados y de última generación. Se hará todo lo posible para cumplir con las pautas de información mínima para la publicación de experimentos de PCR en tiempo real cuantitativos (MIQE) para este estudio. Todas las muestras se analizarán por duplicado con controles positivos y negativos apropiados.

Análisis iniciales de expresión génica: todos los datos de expresión génica se normalizarán en el sistema de PCR en tiempo real Quant Studio 7 Flex. Solo se considerarán en el análisis las muestras que tengan una amplificación satisfactoria de los tres genes de referencia. Previamente, los genes han sido informativos de forma binaria (+/- expresión). Sin embargo, para los fines de este estudio, estaremos preparados para calcular la expresión génica relativa de cada gen objetivo con el método del umbral del ciclo delta delta (ΔΔCt). De acuerdo con las pautas de MIQE, utilizaremos los tres genes de referencia para la normalización y determinaremos una media geométrica de su Ct en cada muestra para calcular la expresión génica relativa.

Seguimiento del desarrollo neurológico: como parte del estándar de atención, cada sitio completará la 3.ª edición de las Escalas de desarrollo de bebés y niños pequeños de Bayley, en EPI a los 18 a 24 meses de edad corregida (CA). Las principales subpruebas de interés incluyen motricidad fina, motricidad gruesa, cognición y lenguaje. Estos datos se registrarán, analizarán y correlacionarán con los resultados de alimentación en el período neonatal y posnatal, los datos de expresión génica y el estado de la intervención. Además, se registrarán los parámetros de crecimiento, incluida la circunferencia de la cabeza, la longitud y el peso.