Somatosensorisk modulering af spytgenekspression og oral fodring hos præmature spædbørn

Formålet med denne undersøgelse er at kombinere molekylære og adfærdsmæssige metoder i en eksperimentel konceptualiseringstilgang til at kortlægge virkningerne af trigeminus (PULSED orokutan) somatosensorisk stimulering på spytgenekspression i forbindelse med erhvervelsen af ​​en udsøgt kompleks oromotorisk færdighed, nemlig oral fodring, hos højrisiko nyfødte. Formålet med denne undersøgelse repræsenterer det første forsøg på at kombinere ikke-invasive behandlingsstrategier og transkriptomiske vurderinger af højrisiko-EPI'er for at (1) forbedre oral fodringsadfærd og -færdigheder, (2) fremme vores forståelse af genontologien af ​​biologisk forskellige veje relateret til oral fodring, (3) bruge genekspressionsdata til at personalisere neonatal pleje og individualisere behandlingsstrategier og timing af interventioner, og (4) forbedre langsigtede udviklingsresultater. Denne integrerede tilgang til oral ernæring er et paradigmeskifte inden for neonatal pleje, hvor hurtigt nye teknologiske fremskridt og personaliseret transkriptomi sikkert og ikke-invasivt kan bringes til den neonatale seng for at informere lægebehandlingsbeslutninger og forbedre pleje og resultater.

Metoder Deltagere: Kun EPI'er født mellem 24 0/7 og 28 6/7 ugers svangerskab, som bestemt ved obstetrisk ultralyd ved < 15 uger eller sidste menstruation, er berettiget til at deltage i denne undersøgelse. Vi vil aktivt tilmelde EPI'er, når de har en korrigeret PCA på ≥ 29 uger for at begrænse antallet af spædbørn, der udvikler alvorlige følgesygdomme efter præmaturitet og ikke ville være kvalificerede til denne undersøgelse baseret på kriterierne anført nedenfor. Forældre til tilmeldte forsøgspersoner vil modtage et Babies R Us-gavekort på $50 for deres deltagelse. Forsøgspersoner vil blive rekrutteret fra fire neonatale intensivafdelinger, herunder 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], og 4) Børnehospitalet Orange Country [Los Angeles, CA] af en undersøgelsessteds PI/Co-Investigator eller den neonatale undersøgelseskoordinator. Informeret samtykke vil blive indhentet før deltagernes deltagelse i undersøgelsen efter samråd med den behandlende læge og sygeplejerske(r). I alt 180 EPI'er (ca. lige mange mænd og kvinder, ingen udelukkelse baseret på race/etnicitet) vil deltage i undersøgelsen (styrke >.85, Type I-fejl <.05).

Eksklusionskriterier: EPI'er vil ikke blive rekrutteret til denne undersøgelse, hvis de har nogen af ​​følgende: 1) kromosomale og medfødte anomalier, herunder kraniofaciale misdannelser, nervesystemanomalier, cyanotisk medfødt hjertesygdom, gastroschisis, omphalocele, diaphragmatisk brok og/eller andre større gastrointestinale sygdomme anomalier; 2) medfødt infektion, 3) ingen dokumenteret GA, 4) svær IUGR (3%), 5) unormal neurologisk status inklusive hovedomkreds < 10. eller > 90. percentil, intrakraniel blødning grad III og IV, kramper, meningitis, neurologisk undersøgelse, der viser unormal tonus eller bevægelser af alle ekstremiteter for PCA; 6) historie med nekrotiserende enterocolitis (stadium II og III); og 7) kulturpositiv sepsis på tidspunktet for studietilmelding.

Protokol: EPI'er vil blive stratificeret i to svangerskabsaldersgrupper (24 0/7 - 26 6/7 uger og 27 0/7 - 28 6/7 uger). Hvert spædbarn vil blive randomiseret til at modtage enten PULSED NTrainer- eller SHAM-interventionen ved hjælp af en software tilfældig heltalfunktion i Minitab v.17 (www.minitab.com). Spædbørn, der er tildelt PULSED NTrainer-gruppen, vil modtage en progressiv dosis af den pulserende orokutane stimulering. Begyndende ved 30 ugers PCA vil disse spædbørn modtage 2 ugers lavdosis PULSED NTrainer-stimulering (2 x 3-minutters blokke) med en 1-minutters stimulus 'off-periode' mellem stimuleringsblokkene. Denne form for stimulering vil blive givet samtidig med sondeernæring 3 gange/dag. Stimulusdosis vil derefter øges i løbet af de næste 2 uger (3 x 3-minutters blokke af PULSED NTrainer-stimulering) med en 1-minutters stimulus 'off-periode' mellem stimulationsblokkene, også givet samtidig med sondeernæring 3 gange/dag . EPI'er randomiseret til SHAM-tilstanden vil få en almindelig silikonesut under sondeernæring i samme tidsrum.

En hvileperiode på 1 minut (ingen stimulering) forekommer mellem stimulationsblokkene. Kriterier for initiering af orokutan terapi omfatter følgende: 1) stabile vitale tegn og ikke på kontinuerlig vasopressormedicin; 2) at tolerere enteral fodring i de foregående 48 timer; og 3) ikke intuberet og mekanisk ventileret. Hvis spædbarnet er på nasal intermitterende positivt trykventilation, kontinuerligt positivt luftvejstryk eller næsekanyle >2 liter i minuttet, så skal FiO2 være <40%.

NNS Assessment og Automatiseret NNS Digital Signal Processing og Feature Extraction: Ud over de orale stimuleringsinterventioner (PULSED NTrainer vs. SHAM sut), vil alle undersøgelsesbørn blive vurderet 3 gange om ugen (f.eks. M/W/K) for NNS præstation . NTrainer-systemet vil blive brugt i 'vurderingstilstand' til at registrere kompressionsdynamikken af ​​NNS under en 3-minutters session umiddelbart forud for en sondeernæring, der ikke er forbundet med en interventionstilstand.

Den mest aktive 2-minutters periode med NNS-adfærd baseret på sugecyklustælling udtrækkes automatisk fra hver sugevurderingsdatafil ved hjælp af en automatisk udtræksalgoritme for kurveformfunktioner på NTrainer-systemet. Trykspidser > 1,6 cm H2O udsættes for ekstraktionskriterier, herunder sugecyklussymmetri, cyklusvarighed og burst-identifikation defineret som to eller flere NNS-hændelser, der forekommer inden for 1200 ms. Denne algoritme tillader objektiv identifikation af NNS-burst-aktivitet adskilt fra ikke-NNS-mundkompressioner eller tungestød mod sutten. Fire mål vil blive objektivt ekstraheret fra de indekserede registreringer af sugekomprimering, inklusive minutfrekvenser for (1) NNS-bursts, hvor en individuel burst omfatter 2 eller flere sugecyklusser, (2) NNS-cyklushændelser defineret som sugekomprimeringscyklusser med mindre cyklusperioder end 1200 ms, (3) samlede orale kompressioner defineret som summen af ​​alle trykhændelser og (4) NNS-kompressionstryk udtrykt i cm H2O.

Fremme af PO-fodring: EPI'er vil gå videre med en standardiseret cue-baseret fodringsplan, der anvendes af hver NICU på stedet, kendt som Infant Driven Feeding®, som vil føre til fuld brystvorter. Denne standardisering af fremskridt med oral fodring på tværs af websteder vil begrænse konfoundere, der i sidste ende kan skævvride dataene.

Spytopsamling, behandling og genekspressionsanalyse: Spytopsamling: Spytprøver vil blive indsamlet fra alle tilmeldte spædbørn den første dag før modtagelse af enten SHAM- eller PULSED NTrainer-interventionen. Denne prøve vil tjene som vores baseline genekspressionsprofil. Der vil derefter blive taget prøver to gange om ugen (~ 3 dages intervaller) op til tidspunktet for opnåelse af fuld oral fodring eller udskrivning hjem fra hospitalet med enten en nasogastrisk sonde (NG) eller gastronomisonde.

Spytprøver på hvert sted vil blive indsamlet med teknikker, der er blevet optimeret og valideret gennem Maron-laboratoriet. Kort fortalt vil spytprøver blive opsamlet med en 1 mL sprøjte, endehætter fjernet og fastgjort til lavvægssugning. Spyt vil blive opsamlet i cirka 20 sekunder og straks stabiliseret i 500 μL af Qiagens RNA Protect Saliva for at standse ændringer i genekspression, hæmme destruktive RNaser og begrænse mikrobiel overvækst. Prøver vil blive hvirvlet kort og frosset ved -20 grader C. Når de først er frosset, er prøverne stabile i op til 18 måneder før behovet for total RNA-ekstraktion. Således vil prøver fra Nebraska og Santa Clara blive sendt en gang om måneden på is natten over til Maron-laboratoriet på Mother Infant Research Institute ved Tufts Medical Center i Boston, MA til behandling.

Generering af en spytbiobank: En ekstra spytprøve vil blive indhentet hver uge fra alle tilmeldte forsøgspersoner for at generere et biobankdepot. Banking af en ekstra prøve hver uge fra forsøgspersoner vil sikre, at vi begrænser tab af datapunkter. Vi forventer, at der er informative spytbiomarkører for oral fodringsmodning, som endnu ikke er identificeret. Ved at generere en biobank af yderligere spytprøver, der retrospektivt kan udspørges på enten en mikroarray-genekspressionsplatform eller med RNASeq, vil vi have potentialet til at opdage nye hypoteser om gen-gen-interaktioner og/eller transskriptionelle regulatoriske processer relateret til oral fodring i EPI-population.

Total RNA-ekstraktion: Spytprøver vil blive ekstraheret for total-RNA ved hjælp af etablerede protokoller, der er optimeret i Maron-laboratoriet. RNA-ekstraktion vil ske med QIAGEN RNAProtect Saliva Mini-sættet i henhold til producentens instruktioner. På kolonnen vil DNase-behandling blive udført for hver prøve for at eliminere genomisk DNA-kontamination. Prøver, der er en del af biobanken, vil blive frosset ved -80°C i afventning af behov for fremtidig analyse. Prøver, der vil blive brugt til RT-qPCR-eksperimenter, vil først gennemgå cDNA-konvertering med Life Technologies SuperScript Vilo-kittet i henhold til producentens instruktioner. cDNA vil blive opbevaret ved -80°C i Mother Infant Research Institute ved Tufts Medical Center i afventning af genekspressionsanalyse.

Genekspressionsanalyse: Med henblik på denne undersøgelse vil vi undersøge hver prøve for ni gener, seks målgener af interesse og tre referencegener til kvalitetskontrol og potentiel normalisering af genekspressionsdata. Gener, der skal analyseres i denne undersøgelse, har tidligere vist sig at være direkte forbundet med oral fodring hos den nyfødte og inkluderer PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK og NPHP4. De tre referencegener inkluderer GAPDH, HPRT1 og YWHAZ, som alle har vist sig at opretholde stabil genekspression på tværs af fremadskridende PCA. Alle cDNA-prøver vil gennemgå en målrettet præ-amplifikation med en tilpasset TaqMan® PreAmp Master Mix for alle ni gener. Denne målrettede tilgang til amplifikation vil sikre, at kun de gener af interesse vil blive amplificeret og ikke alle gener på tværs af transkriptomet, som kan indføre bias. Præamplificeret cDNA vil derefter gennemgå PCR med TaqMan Fast Advance Master Mix på Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Dette instrument er anbragt hos Mother Infant Research Institute på Tufts Medical Center og er en avanceret state-of-the-art PCR-maskine og softwaresystem. Alle bestræbelser vil blive gjort for at overholde retningslinjerne for minimumsoplysninger for offentliggørelse af kvantitative realtids-PCR-eksperimenter (MIQE) for denne undersøgelse. Alle prøver vil blive kørt i to eksemplarer med passende positive og negative kontroller.

Indledende genekspressionsanalyser: Alle genekspressionsdata vil blive normaliseret på Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Kun prøver, der har succesfuld amplifikation af alle tre referencegener, vil blive taget i betragtning i analysen. Tidligere har gener været informative på en binær måde (+/- udtryk). Men til formålet med denne undersøgelse vil vi være forberedt på at beregne relativ genekspression af hvert målgen med delta delta cyklus tærskel (ΔΔCt) metoden. I overensstemmelse med MIQE-retningslinjerne vil vi bruge de tre referencegener til normalisering og bestemme et geometrisk gennemsnit af deres Ct i hver prøve for at beregne relativ genekspression.

Neuroudviklingsopfølgning: Som en del af standardbehandlingen vil hvert sted fuldføre Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Edition, på EPI'er ved 18 til 24 måneders korrigeret alder (CA). De primære undertest af interesse inkluderer finmotorik, grovmotorik, kognition og sprog. Disse data vil blive registreret, analyseret og korreleret med fodringsresultater i den neo- og postnatale periode, genekspressionsdata og interventionsstatus. Derudover vil vækstparametre inklusive hovedomkreds, længde og vægt blive registreret.