Somatosensoryczna modulacja ekspresji genów w ślinie i karmienia doustnego u wcześniaków

Celem tego badania jest połączenie metod molekularnych i behawioralnych w eksperymentalnym podejściu konceptualizacyjnym w celu zmapowania wpływu stymulacji somatosensorycznej nerwu trójdzielnego (PULSED ustno-skórna) na ekspresję genów śliny w kontekście nabywania niezwykle złożonych umiejętności oromotorycznych, a mianowicie karmienia ustnego, u noworodków ludzkich wysokiego ryzyka. Cele tego badania stanowią pierwszą próbę połączenia nieinwazyjnych strategii leczenia i ocen transkryptomicznych EPI wysokiego ryzyka w celu (1) poprawy zachowania i umiejętności karmienia doustnego, (2) pogłębienia naszego zrozumienia ontologii genów biologicznie zróżnicowanych szlaków związanych do karmienia doustnego, (3) wykorzystanie danych dotyczących ekspresji genów do personalizacji opieki nad noworodkiem i zindywidualizowania strategii leczenia i interwencji czasowych oraz (4) poprawy długoterminowych wyników rozwojowych. To integracyjne podejście do karmienia doustnego stanowi zmianę paradygmatu w opiece nad noworodkiem, gdzie szybko pojawiające się postępy technologiczne i spersonalizowana transkryptomika mogą być bezpiecznie i nieinwazyjnie przenoszone do łóżka noworodka w celu podejmowania decyzji dotyczących opieki medycznej oraz poprawy opieki i wyników.

Metody Uczestnicy: Do badania kwalifikują się wyłącznie EPI urodzone pomiędzy 24 0/7 a 28 6/7 tygodniem ciąży, co zostało stwierdzone za pomocą ultrasonografii położniczej < 15 tygodni lub ostatniej miesiączki. Będziemy aktywnie rejestrować EPI, gdy uzyskają skorygowany PCA ≥ 29 tygodni, aby ograniczyć liczbę niemowląt, u których wystąpią poważne następstwa wcześniactwa i które nie kwalifikują się do tego badania w oparciu o kryteria wymienione poniżej. Rodzice zapisanych osób otrzymają kartę podarunkową Babies R o wartości 50 USD za udział. Pacjenci będą rekrutowani z czterech oddziałów intensywnej terapii noworodków, w tym 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], oraz 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] przez kierownika ośrodka badawczego/współbadacza lub koordynatora badania noworodków. Świadoma zgoda zostanie uzyskana przed przystąpieniem uczestników do badania, po konsultacji z lekarzem prowadzącym i pielęgniarką(ami). W badaniu weźmie udział łącznie 180 EPI (w przybliżeniu taka sama liczba mężczyzn i kobiet, bez wykluczeń ze względu na rasę/pochodzenie etniczne) (moc > 0,85, błąd typu I < 0,05).

Kryteria wykluczenia: EPI nie będą rekrutowani do tego badania, jeśli mają którekolwiek z poniższych: 1) anomalie chromosomalne i wrodzone, w tym malformacje twarzoczaszki, anomalie układu nerwowego, sinicową wrodzoną wadę serca, wytrzewienie, przepuklinę pępkową, przepuklinę przeponową i/lub inne poważne zaburzenia żołądkowo-jelitowe anomalie; 2) wrodzona infekcja, 3) brak udokumentowanego GA, 4) ciężki IUGR (3%), 5) nieprawidłowy stan neurologiczny, w tym obwód głowy < 10 lub > 90 percentyla, krwotok śródczaszkowy stopnia III i IV, drgawki, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, nieprawidłowe wyniki badania neurologicznego napięcie lub ruchy wszystkich kończyn dla PCA; 6) historia martwiczego zapalenia jelit (II i III stopień); oraz 7) posocznica z dodatnim posiewem w momencie włączenia do badania.

Protokół: EPI zostaną podzielone na dwie grupy wiekowe (24 0/7 - 26 6/7 tygodni i 27 0/7 - 28 6/7 tygodni). Każde niemowlę zostanie losowo przydzielone do grupy otrzymującej interwencję PULSED NTrainer lub SHAM przy użyciu programowej funkcji losowych liczb całkowitych w oprogramowaniu Minitab v.17 (www.minitab.com). Niemowlęta przydzielone do grupy PULSED NTrainer otrzymają progresywną dawkę pulsacyjnej stymulacji ustno-skórnej. Począwszy od 30 tygodnia PCA, niemowlęta te będą otrzymywać przez 2 tygodnie stymulację PULSED NTrainer w niskiej dawce (2 x 3-minutowe bloki) z 1-minutową „okresem przerwy” pomiędzy blokami stymulacji. Ta forma stymulacji będzie podawana równocześnie z karmieniem przez sondę 3 razy dziennie. Dawka bodźca zostanie następnie zwiększona w ciągu następnych 2 tygodni (3 x 3-minutowe bloki stymulacji PULSED NTrainer) z 1-minutową „przerwą” na bodziec między blokami stymulacji, również podawana jednocześnie z karmieniem przez sondę 3 razy dziennie . EPI przydzielone losowo do stanu SHAM otrzymają zwykły silikonowy smoczek podczas karmienia przez sondę w tym samym okresie.

Pomiędzy blokami stymulacji następuje 1-minutowa przerwa (bez stymulacji). Kryteria rozpoczęcia terapii ustno-skórnej obejmują: 1) stabilne parametry życiowe i niestosowanie ciągłych leków wazopresyjnych; 2) tolerowanie żywienia dojelitowego w ciągu ostatnich 48 godzin; oraz 3) nie zaintubowane i wentylowane mechanicznie. Jeśli niemowlę jest wentylowane przez nos z przerywanym dodatnim ciśnieniem, ciągłym dodatnim ciśnieniem w drogach oddechowych lub kaniulą nosową > 2 litry na minutę, wówczas FiO2 musi wynosić <40%.

Ocena NNS i zautomatyzowane cyfrowe przetwarzanie sygnału NNS i ekstrakcja cech: Oprócz interwencji w zakresie stymulacji jamy ustnej (smoczek PULSED NTrainer vs. smoczek SHAM), wszystkie badane niemowlęta będą oceniane 3 razy w tygodniu (np. M/K/K) pod kątem sprawności NNS . System NTrainer będzie używany w „trybie oceny” do rejestrowania dynamiki ucisku NNS podczas 3-minutowej sesji bezpośrednio poprzedzającej karmienie przez zgłębnik, które nie jest związane ze stanem interwencji.

Najbardziej aktywny 2-minutowy okres zachowania NNS w oparciu o liczbę cykli ssania jest automatycznie wyodrębniany z każdego pliku danych oceny ssania za pomocą algorytmu automatycznego wyodrębniania cech fali w systemie NTrainer. Piki ciśnienia > 1,6 cm H2O podlegają kryteriom ekstrakcji cech, w tym symetrii cyklu ssania, długości cyklu i identyfikacji wybuchu zdefiniowanej jako dwa lub więcej zdarzeń NNS występujących w ciągu 1200 ms. Algorytm ten pozwala na obiektywną identyfikację aktywności wybuchu NNS w odróżnieniu od uciśnięć ust innych niż NNS lub pchnięć językiem w smoczek. Cztery miary zostaną obiektywnie wyodrębnione z indeksowanych zapisów uciśnięć ssania, w tym częstości minut dla (1) impulsów NNS, w przypadku których pojedynczy impuls obejmuje 2 lub więcej cykli ssania, (2) Zdarzenia cyklu NNS zdefiniowane jako cykle uciśnięć ssania z okresami cyklu krótszymi niż 1200 ms, (3) Całkowita liczba uciśnięć jamy ustnej zdefiniowana jako suma wszystkich zdarzeń ciśnieniowych oraz (4) Ciśnienie uciśnięć NNS wyrażone w cm H2O.

Postęp w karmieniu PO: EPI będą postępowały zgodnie ze znormalizowanym harmonogramem karmienia opartym na wskazówkach, stosowanym przez każdy oddział NICU, znanym jako Infant Driven Feeding®, który doprowadzi do pełnego karmienia sutkami. Ta standaryzacja postępów w żywieniu doustnym w różnych ośrodkach ograniczy czynniki zakłócające, które mogą ostatecznie zniekształcić dane.

Pobieranie śliny, przetwarzanie i analiza ekspresji genów: Pobieranie śliny: Próbki śliny będą pobierane od wszystkich zapisanych niemowląt pierwszego dnia przed otrzymaniem interwencji SHAM lub PULSED NTrainer. Ta próbka posłuży jako nasz podstawowy profil ekspresji genów. Próbki będą następnie pobierane dwa razy w tygodniu (w odstępach około 3 dni) do czasu osiągnięcia pełnego karmienia doustnego lub wypisu do domu ze szpitala za pomocą sondy nosowo-żołądkowej (NG) lub sondy gastronomicznej.

Próbki śliny w każdym miejscu zostaną pobrane za pomocą technik, które zostały zoptymalizowane i zatwierdzone przez laboratorium Maron. W skrócie, próbki śliny zostaną pobrane za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, usunięte zaślepki i podłączone do ssawki o niskiej ściance. Ślina będzie zbierana przez około 20 sekund i natychmiast stabilizowana w 500 μl RNA Protect Saliva firmy Qiagen, aby zatrzymać zmiany w ekspresji genów, zahamować destrukcyjne RNazy i ograniczyć przerost drobnoustrojów. Próbki zostaną krótko worteksowane i zamrożone w temperaturze -20°C. Po zamrożeniu próbki są stabilne przez okres do 18 miesięcy przed koniecznością ekstrakcji całkowitego RNA. Tak więc próbki z Nebraski i Santa Clara będą wysyłane raz w miesiącu na lodzie przez noc do laboratorium Maron w Mother Infant Research Institute w Tufts Medical Center w Bostonie w stanie Massachusetts w celu przetworzenia.

Generowanie biobanku śliny: co tydzień pobierana będzie jedna dodatkowa próbka śliny od wszystkich zapisanych osób w celu utworzenia repozytorium biobanku. Cotygodniowe gromadzenie dodatkowej próbki od badanych osób zapewni ograniczenie utraty punktów danych. Przewidujemy, że istnieją informacyjne biomarkery śliny dojrzewania karmienia doustnego, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Tworząc biobank dodatkowych próbek śliny, które można retrospektywnie przesłuchać na platformie do ekspresji genów mikromacierzy lub za pomocą RNASeq, będziemy mogli odkryć nowe hipotezy dotyczące interakcji gen-gen i/lub transkrypcyjnych procesów regulacyjnych związanych z karmieniem doustnym w Populacja EPI.

Ekstrakcja całkowitego RNA: Próbki śliny zostaną pobrane pod kątem całkowitego RNA przy użyciu ustalonych protokołów zoptymalizowanych w laboratorium Maron. Ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona za pomocą zestawu QIAGEN RNAProtect Saliva Mini zgodnie z instrukcjami producenta. Na kolumnie dla każdej próbki zostanie przeprowadzone traktowanie DNazą w celu wyeliminowania zanieczyszczenia genomowym DNA. Próbki, które są częścią biobanku, zostaną zamrożone w temperaturze -80°C w oczekiwaniu na przyszłe analizy. Próbki, które zostaną użyte do eksperymentów RT-qPCR, zostaną najpierw poddane konwersji cDNA za pomocą zestawu Life Technologies SuperScript Vilo zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA będzie przechowywane w -80°C w Mother Infant Research Institute w Tufts Medical Center do czasu analizy ekspresji genów.

Analiza ekspresji genów: Na potrzeby tego badania każdą próbkę zbadamy pod kątem dziewięciu genów, sześciu docelowych genów będących przedmiotem zainteresowania i trzech genów referencyjnych w celu kontroli jakości i potencjalnej normalizacji danych dotyczących ekspresji genów. Wcześniej wykazano, że geny, które mają być analizowane w tym badaniu, są bezpośrednio związane z karmieniem doustnym noworodka i obejmują PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK i NPHP4. Trzy geny referencyjne obejmują GAPDH, HPRT1 i YWHAZ, z których wszystkie wykazano, że utrzymują stabilną ekspresję genów w postępującym PCA. Wszystkie próbki cDNA zostaną poddane ukierunkowanej wstępnej amplifikacji za pomocą niestandardowego TaqMan® PreAmp Master Mix dla wszystkich dziewięciu genów. To ukierunkowane podejście do amplifikacji zapewni amplifikację tylko tych genów, które są przedmiotem zainteresowania, a nie wszystkich genów w transkryptomie, co może wprowadzać błąd systematyczny. Wstępnie amplifikowane cDNA zostanie następnie poddane PCR z TaqMan Fast Advance Master Mix w systemie Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Instrument ten znajduje się w Mother Infant Research Institute w Tufts Medical Center i jest zaawansowaną, najnowocześniejszą maszyną do PCR i systemem oprogramowania. Dołożymy wszelkich starań, aby zachować zgodność z wytycznymi dotyczącymi minimalnych informacji potrzebnych do publikacji ilościowych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym (MIQE). Wszystkie próbki będą analizowane w dwóch powtórzeniach z odpowiednimi kontrolami dodatnimi i ujemnymi.

Wstępne analizy ekspresji genów: Wszystkie dane dotyczące ekspresji genów zostaną znormalizowane w systemie Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR. W analizie zostaną uwzględnione tylko próbki, które pomyślnie zamplifikowały wszystkie trzy geny referencyjne. Wcześniej geny były informacyjne w sposób binarny (ekspresja +/-). Jednak na potrzeby tego badania będziemy przygotowani do obliczenia względnej ekspresji genów każdego genu docelowego za pomocą metody progu cyklu delta delta (ΔΔCt). Zgodnie z wytycznymi MIQE użyjemy trzech genów referencyjnych do normalizacji i określimy średnią geometryczną ich Ct w każdej próbce, aby obliczyć względną ekspresję genów.

Obserwacja neurorozwojowa: W ramach standardowej opieki, każdy ośrodek uzupełni Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Edition, na EPI w wieku skorygowanym (CA) od 18 do 24 miesięcy. Główne podtesty będące przedmiotem zainteresowania obejmują małą motorykę, dużą motorykę, funkcje poznawcze i język. Dane te będą rejestrowane, analizowane i korelowane z wynikami żywienia w okresie noworodkowym i poporodowym, danymi dotyczącymi ekspresji genów i statusem interwencji. Ponadto rejestrowane będą parametry wzrostu, w tym obwód głowy, długość i waga.