Somatosenzorická modulace exprese slinných genů a orální krmení u předčasně narozených dětí

Účelem této studie je zkombinovat molekulární a behaviorální metody v experimentálním konceptualizačním přístupu s cílem zmapovat účinky trigeminální (PULSED orokutánní) somatosenzorické stimulace na expresi genů ve slinách v kontextu osvojení mimořádně komplexní oromotorické dovednosti, jmenovitě orálního krmení, u vysoce rizikových lidských novorozenců. Cíle této studie představují první pokus o kombinaci neinvazivních léčebných strategií a transkriptomických hodnocení vysoce rizikových EPI za účelem (1) zlepšení chování a dovedností při orálním krmení, (2) prohloubení našeho porozumění genové ontologii biologicky různorodých souvisejících drah. k orálnímu krmení, (3) využívat data genové exprese k personalizaci neonatální péče a individualizovat léčebné strategie a načasování intervencí a (4) zlepšit dlouhodobé vývojové výsledky. Tento integrativní přístup k orálnímu krmení je změnou paradigmatu v péči o novorozence, kde lze rychle se objevující technologický pokrok a personalizovanou transkriptomiku bezpečně a neinvazivně přenést na novorozenecké lůžko, aby poskytly informace o lékařských rozhodnutích a zlepšily péči a výsledky.

Metody Účastníci: Této studie se mohou zúčastnit pouze EPI narozené mezi 24. 0/7 a 28. 6/7 týdnem těhotenství, jak bylo stanoveno porodnickým ultrazvukem v < 15 týdnech nebo poslední menstruaci. Aktivně zařadíme EPI, jakmile budou mít opravenou PCA ≥ 29 týdnů, abychom omezili počet kojenců, u kterých se rozvinou závažné následky nedonošenosti a kteří by nebyli způsobilí pro tuto studii na základě kritérií uvedených níže. Rodiče zapsaných předmětů obdrží za účast dárkovou kartu Babies R Us v hodnotě 50 USD. Subjekty budou rekrutovány ze čtyř neonatálních jednotek intenzivní péče, včetně 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], a 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] studijním pracovištěm PI/Co-Investigator nebo koordinátorem neonatální studie. Informovaný souhlas bude získán před vstupem účastníků do studie po konzultaci s ošetřujícím lékařem a sestrou (sestrami). Studie se zúčastní celkem 180 EPI (přibližně stejný počet mužů a žen, žádné vyloučení na základě rasy/etnické příslušnosti) (síla > 0,85, chyba typu I < 0,05).

Kritéria vyloučení: EPI nebudou přijati do této studie, pokud budou mít některou z následujících vlastností: 1) chromozomální a vrozené anomálie včetně kraniofaciálních malformací, anomálií nervového systému, cyanotické vrozené srdeční choroby, gastroschízy, omfalokély, brániční kýly a/nebo jiné velké gastrointestinální kýly anomálie; 2) vrozená infekce, 3) žádný dokumentovaný GA, 4) těžký IUGR (3 %), 5) abnormální neurologický stav včetně obvodu hlavy < 10 nebo > 90 percentil, intrakraniální krvácení stupně III a IV, záchvaty, meningitida, neurologické vyšetření ukazující abnormální tón nebo pohyby všech končetin pro PCA; 6) anamnéza nekrotizující enterokolitidy (stadium II a III); a 7) kultivačně pozitivní sepse v době zápisu do studie.

Protokol: EPI budou stratifikovány mezi dvě skupiny gestačního věku (24 0/7 - 26 6/7 týdnů a 27 0/7 - 28 6/7 týdnů). Každé dítě bude randomizováno tak, aby dostalo buď zásah PULSED NTrainer nebo SHAM pomocí softwarové funkce náhodného celého čísla v Minitab v.17 (www.minitab.com). Kojenci zařazeni do skupiny PULSED NTrainer dostanou progresivní dávku pulzační orokutánní stimulace. Počínaje 30. týdnem PCA budou tyto děti dostávat 2 týdny stimulace nízkými dávkami PULSED NTrainer (2 x 3minutové bloky) s 1minutovou „pauzou“ mezi stimulačními bloky. Tato forma stimulace bude podávána současně s krmením sondou 3krát denně. Stimulační dávka se pak bude během následujících 2 týdnů zvyšovat (3 x 3minutové bloky stimulace PULSED NTrainer) s 1minutovou „pauzou“ stimulu mezi stimulačními bloky, rovněž podávanou současně s podáváním sondové výživy 3krát denně . EPI náhodně vybrané do stavu SHAM dostanou během krmení sondou ve stejném časovém období běžný silikonový dudlík.

Mezi stimulačními bloky nastává 1 minutová přestávka (bez stimulace). Kritéria pro zahájení orokutánní terapie zahrnují následující: 1) stabilní vitální funkce a nikoli na kontinuální vazopresorické medikaci; 2) tolerování enterální výživy v předchozích 48 hodinách; a 3) neintubované a mechanicky ventilované. Pokud je dítě na nosní přerušované přetlakové ventilaci, nepřetržitém přetlaku v dýchacích cestách nebo nosní kanyle > 2 litry za minutu, pak musí být FiO2 < 40 %.

Hodnocení NNS a automatické zpracování digitálního signálu NNS a extrakce funkcí: Kromě intervencí orální stimulace (PULSED NTrainer vs. dudlík SHAM) budou všechna studovaná kojenci hodnocena 3krát týdně (např. M/W/F) na výkonnost NNS . Systém NTrainer bude použit v „režimu hodnocení“ k zaznamenání kompresní dynamiky NNS během 3minutové relace, která bezprostředně předchází podávání sondy, které není spojeno s intervenční podmínkou.

Nejaktivnější 2minutová perioda chování NNS založená na počtu cyklů sání je automaticky extrahována z každého souboru dat hodnocení sání pomocí algoritmu automatické extrakce vlastností křivky v systému NTrainer. Tlakové vrcholy > 1,6 cm H2O jsou podrobeny kritériím pro extrakci vlastností, včetně symetrie cyklu sání, trvání cyklu a identifikace burst definovaných jako dvě nebo více událostí NNS, ke kterým dojde během 1200 ms. Tento algoritmus umožňuje objektivní identifikaci aktivity výbuchu NNS odlišnou od stlačení ústy bez NNS nebo přitlačení jazyka proti dudlíku. Z indexovaných záznamů sací komprese budou objektivně extrahovány čtyři míry, včetně minutových rychlostí pro (1) výbuchy NNS, kde jednotlivý výbuch zahrnuje 2 nebo více cyklů sání, (2) události cyklu NNS definované jako cykly sání sání s kratšími periodami cyklu než 1200 ms, (3) celkové orální komprese definované jako součet všech tlakových událostí a (4) kompresní tlak NNS vyjádřený v cm H2O.

Pokrok v krmení PO: EPI budou postupovat podle standardizovaného rozvrhu krmení založeného na podnětech, který využívá každá místní NICU, známého jako kojenecké krmení®, což povede k úplnému krmení bradavek. Tato standardizace pokroku v orálním krmení napříč weby omezí matoucí, kteří mohou v konečném důsledku zkreslit data.

Odběr slin, zpracování a analýza genové exprese: Odběr slin: Vzorky slin budou odebrány od všech zapsaných kojenců první den před přijetím buď SHAM nebo PULSED NTrainer intervence. Tento vzorek bude sloužit jako náš základní profil genové exprese. Vzorky pak budou odebírány dvakrát týdně (~ 3denní intervaly) až do doby dosažení plné perorální výživy nebo propuštění domů z nemocnice buď nazogastrickou sondou (NG) nebo gastronomickou sondou.

Vzorky slin na každém místě budou odebírány technikami, které byly optimalizovány a ověřeny v laboratoři Maron. Stručně, vzorky slin budou odebírány 1 ml injekční stříkačkou, koncové uzávěry odstraněny a připojeny k nízkému odsávání. Sliny budou shromažďovány po dobu přibližně 20 sekund a okamžitě stabilizovány v 500 μl slin Qiagen RNA Protect Saliva, aby se zastavily změny genové exprese, inhibovaly destruktivní RNázy a omezil se přemnožení mikrobů. Vzorky budou krátce vortexovány a zmraženy při -20 °C. Po zmrazení jsou vzorky stabilní po dobu až 18 měsíců, než je potřeba provést extrakci celkové RNA. Vzorky z Nebrasky a Santa Clary budou tedy jednou měsíčně zasílány na ledu přes noc do laboratoře Maron ve Výzkumném institutu matek v Tufts Medical Center v Bostonu, MA ke zpracování.

Vytvoření biobanky slin: Každý týden bude od všech zapsaných subjektů získán jeden další vzorek slin, aby se vytvořilo úložiště biobanky. Bankování dalšího vzorku každý týden od subjektů studie zajistí, že omezíme ztrátu datových bodů. Předpokládáme, že existují informativní slinné biomarkery zrání orálního krmení, které dosud nebyly identifikovány. Vytvořením biobanky dalších vzorků slin, které mohou být retrospektivně zkoumány buď na platformě pro expresi genů microarray, nebo pomocí RNASeq, budeme mít potenciál objevit nové hypotézy o interakcích gen-gen a/nebo transkripčních regulačních procesech souvisejících s orálním krmením v Populace EPI.

Extrakce celkové RNA: Vzorky slin budou extrahovány na celkovou RNA pomocí zavedených protokolů optimalizovaných v laboratoři Maron. Extrakce RNA se provede pomocí sady QIAGEN RNAProtect Saliva Mini podle pokynů výrobce. Na koloně bude pro každý vzorek provedeno ošetření DNázou, aby se eliminovala kontaminace genomovou DNA. Vzorky, které jsou součástí biobanky, budou zmraženy na -80°C až do potřeby budoucí analýzy. Vzorky, které budou použity pro experimenty RT-qPCR, budou nejprve podrobeny konverzi cDNA pomocí sady Life Technologies SuperScript Vilo podle pokynů výrobce. cDNA bude uchovávána při -80 °C ve Výzkumném ústavu pro matky v Tufts Medical Center až do analýzy genové exprese.

Analýza genové exprese: Pro účely této studie budeme v každém vzorku zkoumat devět genů, šest cílových genů zájmu a tři referenční geny pro kontrolu kvality a potenciální normalizaci dat genové exprese. Již dříve bylo prokázáno, že geny, které mají být analyzovány v této studii, jsou přímo spojeny s orální výživou u novorozenců a zahrnují PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK a NPHP4. Tyto tři referenční geny zahrnují GAPDH, HPRT1 a YWHAZ, u všech bylo prokázáno, že udržují stabilní genovou expresi napříč postupující PCA. Všechny vzorky cDNA projdou cílenou předamplifikací s vlastní TaqMan® PreAmp Master Mix pro všech devět genů. Tento cílený přístup k amplifikaci zajistí, že budou amplifikovány pouze ty geny, které jsou předmětem zájmu, a ne všechny geny napříč transkriptomem, které mohou zavést zkreslení. Předamplifikovaná cDNA pak podstoupí PCR s TaqMan Fast Advance Master Mix na Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Tento nástroj je umístěn ve Výzkumném ústavu pro matky v Tufts Medical Center a je to pokročilý nejmodernější stroj a softwarový systém PCR. Veškeré úsilí bude vynaloženo na dodržování pokynů pro minimální informace pro zveřejnění kvantitativních experimentů PCR v reálném čase (MIQE) pro tuto studii. Všechny vzorky budou testovány v duplikátech s vhodnými pozitivními a negativními kontrolami.

Počáteční analýzy genové exprese: Všechna data genové exprese budou normalizována na systému Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. V analýze budou brány v úvahu pouze vzorky, které mají úspěšnou amplifikaci všech tří referenčních genů. Dříve byly geny informativní binárním způsobem (exprese +/-). Pro účely této studie však budeme připraveni vypočítat relativní genovou expresi každého cílového genu metodou delta delta cyklu prahu (ΔACt). V souladu s pokyny MIQE použijeme tři referenční geny pro normalizaci a určíme geometrický průměr jejich Ct v každém vzorku pro výpočet relativní genové exprese.

Následné neurovývojové sledování: V rámci standardní péče každé pracoviště dokončí Bayleyovy škály vývoje kojenců a batolat 3. vydání na EPI ve věku 18 až 24 měsíců (CA). Mezi primární subtesty zájmu patří Jemná motorika, Hrubá motorika, Kognice a Jazyk. Tato data budou zaznamenávána, analyzována a korelována s výsledky krmení v novorozeneckém a postnatálním období, údaji o genové expresi a stavu intervence. Kromě toho budou zaznamenávány růstové parametry včetně obvodu hlavy, délky a hmotnosti.