早产儿唾液基因表达和经口喂养的体感调节

本研究的目的是将分子和行为方法结合在实验概念化方法中，以绘制三叉神经（PULSED orocutaneous）体感刺激对唾液基因表达的影响，在获得精致复杂的口腔运动技能（即口腔喂养）的背景下，在高危人类新生儿中。 本研究的目的是首次尝试将非侵入性治疗策略与高风险 EPI 的转录组学评估相结合，以 (1) 改善经口进食行为和技能，(2) 进一步了解生物多样性相关通路的基因本体到经口喂养，(3) 使用基因表达数据来个性化新生儿护理和个性化治疗策略和时机干预，以及 (4) 改善长期发育结果。 这种经口喂养的综合方法是新生儿护理的范式转变，其中快速出现的技术进步和个性化转录组学可以安全、无创地带到新生儿床边，为医疗护理决策提供信息并改善护理和结果。

方法 参与者：只有在妊娠 24 0/7 和 28 6/7 周之间出生的 EPI，根据产科超声在 < 15 周或末次月经期间确定，才有资格参加本研究。 一旦 EPI 的校正后 PCA ≥ 29 周，我们将积极招募他们，以限制出现严重早产后遗症并且根据下列标准不符合本研究资格的婴儿数量。 已注册受试者的父母将收到一张价值 50 美元的 Babies R Us 礼品卡，以表彰他们的参与。 受试者将从四个新生儿重症监护病房招募，包括 1) CHI Health St. Elizabeth [林肯，内布拉斯加州]，2) 塔夫茨医疗中心 NICU [马萨诸塞州波士顿]，3) 圣克拉拉谷医疗中心 [加利福尼亚州圣何塞]，和 4) 儿童医院奥兰治县 [加利福尼亚州洛杉矶] 由研究中心 PI/共同研究者或新生儿研究协调员提供。 在与主治医师和护士协商后，将在参与者进入研究之前获得知情同意。 总共 180 个 EPI（男性和女性的数量大致相等，没有基于种族/民族的排除）将参与研究（功效 >.85，I 类错误 <.05）。

排除标准：具有以下任何一项的 EPI 将不被招募参加本研究：1）染色体和先天性异常，包括颅面畸形、神经系统异常、紫绀型先天性心脏病、腹裂、脐膨出、膈疝和/或其他主要胃肠道疾病异常情况； 2) 先天性感染，3) 无 GA 记录，4) 严重 IUGR (3%)，5) 异常神经系统状态，包括头围 < 10th 或 > 90th 百分位数，III 级和 IV 级颅内出血，癫痫发作，脑膜炎，神经系统检查显示异常PCA 时四肢的音调或动作； 6) 坏死性小肠结肠炎病史（Ⅱ期和Ⅲ期）；和，7) 研究入组时培养阳性脓毒症。

方案：EPI 将在两个孕龄组（24 0/7 - 26 6/7 周和 27 0/7 - 28 6/7 周）之间分层。 每个婴儿将随机接受 PULSED NTrainer 或 SHAM 干预，使用 Minitab v.17 (www.minitab.com) 中的软件随机整数函数。 分配到 PULSED NTrainer 组的婴儿将接受渐进剂量的脉动性口腔皮肤刺激。 从 30 周的 PCA 开始，这些婴儿将接受 2 周的低剂量 PULSED NTrainer 刺激（2 x 3 分钟块），在刺激块之间有 1 分钟的刺激“关闭期”。 这种形式的刺激将与管饲同时进行，每天 3 次。 然后在接下来的 2 周内增加刺激剂量（3 x 3 分钟的 PULSED NTrainer 刺激块），在刺激块之间有 1 分钟的刺激“关闭期”，同时与管饲同时给予 3 次/天. 随机分配到 SHAM 条件的 EPI 将在同一时间段的管饲期间给予常规硅胶奶嘴。

刺激块之间有 1 分钟的休息时间（无刺激）。 开始经口皮肤治疗的标准包括： 1) 生命体征稳定且未持续服用升压药； 2) 过去 48 小时内耐受肠内喂养； 3) 未插管和机械通气。 如果婴儿采用经鼻间歇正压通气、持续气道正压通气或鼻插管 >2 升/分钟，则 FiO2 必须 <40%。

NNS 评估和自动 NNS 数字信号处理和特征提取：除了口腔刺激干预（PULSED NTrainer 与 SHAM 安抚奶嘴）外，所有研究婴儿每周将评估 3 次（例如，M/W/F）的 NNS 性能. NTrainer 系统将在“评估模式”下使用，以在 3 分钟的会议期间记录 NNS 的压缩动态，以紧接在与干预条件无关的管饲之前。

使用 NTrainer 系统上的自动波形特征提取算法，从每个吸吮评估数据文件中自动提取基于吸吮循环计数的最活跃的 2 分钟 NNS 行为。 > 1.6 cm H2O 的压力峰值受特征提取标准的约束，包括吸入周期对称性、周期持续时间和突发识别，定义为在 1200 毫秒内发生的两个或多个 NNS 事件。 该算法允许客观识别 NNS 突发活动，与非 NNS 嘴巴压缩或舌头推力奶嘴不同。 将从抽吸压缩的索引记录中客观地提取四种测量值，包括 (1) NNS 爆发的分钟速率，其中单个爆发包括 2 个或更多抽吸循环，(2) NNS 循环事件定义为循环周期更少的抽吸压缩循环超过 1200 毫秒，(3) 总口腔按压定义为所有压力事件的总和，以及 (4) NNS 按压压力，以 cm H2O 表示。

PO 喂养进展：EPI 将推进每个站点 NICU 使用的基于提示的标准化喂养计划，称为 Infant Driven Feeding®，这将导致全乳头喂养。 这种跨站点的经口喂养标准化进步将限制可能最终扭曲数据的混杂因素。

唾液收集、处理和基因表达分析： 唾液收集：将在接受 SHAM 或 PULSED NTrainer 干预之前的第一天从所有登记的婴儿收集唾液样本。 该样本将作为我们的基线基因表达谱。 然后每周两次（约 3 天间隔）获取样本，直至实现完全经口进食或使用鼻胃管 (NG) 或胃管出院回家。

每个站点的唾液样本将使用经过 Maron 实验室优化和验证的技术进行收集。 简而言之，将使用 1 mL 注射器收集唾液样本，取下端盖并连接到低壁吸管。 收集唾液约 20 秒，并立即稳定在 500 μL Qiagen 的 RNA Protect Saliva 中，以阻止基因表达变化、抑制破坏性 RNase 并限制微生物过度生长。 样品将短暂涡旋并冷冻在 -20 摄氏度。冷冻后，样品在需要提取总 RNA 之前可稳定长达 18 个月。 因此，来自内布拉斯加州和圣克拉拉的样本将每月一次在冰上连夜运送到马萨诸塞州波士顿塔夫茨医学中心母婴研究所的 Maron 实验室进行处理。

唾液生物库的生成：每周从所有登记的受试者中获得一份额外的唾液样本，以生成生物库。 每周从研究对象中储存一个额外的样本将确保我们将限制数据点的丢失。 我们预计有尚未确定的口服喂养成熟的信息唾液生物标志物。 通过生成额外唾液样本的生物样本库，这些样本可以在微阵列基因表达平台或 RNASeq 上进行回顾性研究，我们将有可能发现关于基因间相互作用和/或与口腔喂养相关的转录调控过程的新假设。 EPI 人口。

总 RNA 提取：将使用在 Maron 实验室优化的既定方案提取唾液样本以获得总 RNA。 RNA 提取将按照制造商的说明使用 QIAGEN RNAProtect Saliva Mini 试剂盒进行。 将对每个样品进行柱上 DNase 处理，以消除基因组 DNA 污染。 作为生物样本库一部分的样本将在-80°C 下冷冻，以备将来分析之用。 将用于 RT-qPCR 实验的样本将首先按照制造商的说明使用 Life Technologies SuperScript Vilo 试剂盒进行 cDNA 转换。 cDNA 将在-80°C 下保存在塔夫茨医学中心的母婴研究所，等待基因表达分析。

基因表达分析：为了本研究的目的，我们将询问每个样本的九个基因、六个感兴趣的目标基因和三个参考基因，以进行质量控制和基因表达数据的潜在标准化。 本研究中要分析的基因先前已被证明与新生儿经口喂养直接相关，包括 PLXNA1、PLXNA3、NPY2R、WNT3、AMPK 和 NPHP4。 三个参考基因包括 GAPDH、HPRT1 和 YWHAZ，所有这些基因都已被证明可以在推进的 PCA 中保持稳定的基因表达。 所有 cDNA 样本都将使用针对所有九个基因的定制 TaqMan® PreAmp Master Mix 进行靶向预扩增。 这种有针对性的扩增方法将确保只扩增那些感兴趣的基因，而不是转录组中可能引入偏差的所有基因。 然后，预扩增的 cDNA 将在 Life Technologies Quant Studio 7 Flex 实时 PCR 系统上使用 TaqMan Fast Advance Master Mix 进行 PCR。 该仪器由塔夫茨医学中心的母婴研究所提供，是一种先进的最先进的 PCR 机器和软件系统。 将尽一切努力遵守本研究发布定量实时 PCR 实验 (MIQE) 指南的最低信息要求。 所有样品将一式两份运行，并带有适当的阳性和阴性对照。

初始基因表达分析：所有基因表达数据将在 Quant Studio 7 Flex 实时 PCR 系统上标准化。 只有成功扩增了所有三个参考基因的样本才会被纳入分析。 以前，基因以二元方式（+/- 表达）提供信息。 然而，出于本研究的目的，我们将准备使用 delta delta 循环阈值 (ΔΔCt) 方法计算每个靶基因的相对基因表达。 根据 MIQE 指南，我们将使用三个参考基因进行归一化，并确定它们在每个样本中的 Ct 的几何平均值，以计算相对基因表达。

神经发育跟进：作为护理标准的一部分，每个站点将在 18 至 24 个月的矫正年龄 (CA) 上完成 Bayley 婴幼儿发育量表第 3 版。 感兴趣的主要子测试包括精细运动、粗大运动、认知和语言。 这些数据将被记录、分析，并与新生儿和产后喂养结果、基因表达数据和干预状态相关联。 此外，还将记录头围、身长和体重等生长参数。