Modulation somatosensorielle de l'expression des gènes salivaires et de l'alimentation orale chez les prématurés

Le but de cette étude est de combiner des méthodes moléculaires et comportementales dans une approche de conceptualisation expérimentale pour cartographier les effets de la stimulation somatosensorielle trijumeau (PULSED orocutanée) sur l'expression des gènes salivaires dans le cadre de l'acquisition d'une compétence oromotrice extrêmement complexe, à savoir l'alimentation orale, chez les nouveau-nés humains à haut risque. Les objectifs de cette étude représentent la première tentative de combiner des stratégies de traitement non invasives et des évaluations transcriptomiques des IPE à haut risque pour (1) améliorer le comportement et les compétences d'alimentation orale, (2) approfondir notre compréhension de l'ontologie des gènes de voies biologiquement diverses liées à l'alimentation orale, (3) utiliser les données d'expression génique pour personnaliser les soins néonatals et individualiser les stratégies de traitement et les interventions de synchronisation, et (4) améliorer les résultats de développement à long terme. Cette approche intégrative de l'alimentation orale est un changement de paradigme dans les soins néonatals où les avancées technologiques émergentes et la transcriptomique personnalisée peuvent être apportées de manière sûre et non invasive au chevet du nouveau-né pour éclairer les décisions en matière de soins médicaux et améliorer les soins et les résultats.

Méthodes Participants : Seuls les EPI nés entre 24 0/7 et 28 6/7 semaines de gestation, tel que déterminé par échographie obstétricale à < 15 semaines ou dernière période menstruelle, sont éligibles pour participer à cette étude. Nous recruterons activement les EPI une fois qu'ils auront une PCA corrigée de ≥ 29 semaines afin de limiter le nombre de nourrissons qui développent des séquelles graves de prématurité et ne seraient pas éligibles pour cette étude sur la base des critères énumérés ci-dessous. Les parents des sujets inscrits recevront une carte-cadeau Babies R Us de 50 $ pour leur participation. Les sujets seront recrutés dans quatre unités de soins intensifs néonatals, dont 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], et 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] par un chercheur principal/co-investigateur du site d'étude ou le coordinateur de l'étude néonatale. Le consentement éclairé sera obtenu avant l'entrée des participants dans l'étude, après consultation avec le médecin traitant et les infirmières. Un total de 180 IPE (nombres approximativement égaux d'hommes et de femmes, aucune exclusion fondée sur la race/l'origine ethnique) participeront à l'étude (puissance > 0,85, erreur de type I < 0,05).

Critères d'exclusion : les EPI ne seront pas recrutés pour cette étude s'ils présentent l'un des éléments suivants : 1) anomalies chromosomiques et congénitales, y compris malformation craniofaciale, anomalies du système nerveux, cardiopathie congénitale cyanotique, gastroschisis, omphalocèle, hernie diaphragmatique et/ou autre trouble gastro-intestinal majeur anomalies; 2) infection congénitale, 3) pas d'AG documenté, 4) RCIU sévère (3 %), 5) état neurologique anormal, y compris circonférence crânienne < 10 ou > 90 centile, hémorragie intracrânienne de grades III et IV, convulsions, méningite, examen neurologique montrant des anomalies tonus ou mouvements de toutes les extrémités pour PCA ; 6) antécédent d'entérocolite nécrosante (stade II et III) ; et, 7) septicémie positive à la culture au moment de l'inscription à l'étude.

Protocole : les EPI seront stratifiés en deux groupes d'âge gestationnel (24 0/7 - 26 6/7 semaines et 27 0/7 - 28 6/7 semaines). Chaque nourrisson sera randomisé pour recevoir l'intervention PULSED NTrainer ou SHAM à l'aide d'une fonction logicielle d'entiers aléatoires dans Minitab v.17 (www.minitab.com). Les nourrissons affectés au groupe PULSED NTrainer recevront une dose progressive de la stimulation orocutanée pulsatile. À partir de 30 semaines d'ACP, ces nourrissons recevront 2 semaines de stimulation PULSED NTrainer à faible dose (2 blocs de 3 minutes) avec une « période d'arrêt » du stimulus d'une minute entre les blocs de stimulation. Cette forme de stimulation sera administrée simultanément avec des gavages 3 fois/jour. La dose de stimulus sera ensuite augmentée au cours des 2 semaines suivantes (3 blocs de 3 minutes de stimulation PULSED NTrainer) avec une période d'arrêt de stimulus d'une minute entre les blocs de stimulation, également administrée simultanément avec des gavages 3 fois/jour . Les EPI randomisés dans la condition SHAM recevront une tétine en silicone régulière pendant les gavages au cours de la même période.

Une période de repos d'une minute (pas de stimulation) se produit entre les blocs de stimulation. Les critères d'initiation du traitement orocutané sont les suivants : 1) signes vitaux stables et absence de traitement vasopresseur continu ; 2) tolérer les alimentations entérales au cours des 48 heures précédentes ; et 3) non intubé et ventilé mécaniquement. Si le nourrisson est sous ventilation nasale à pression positive intermittente, pression positive continue ou canule nasale > 2 litres par minute, la FiO2 doit être < 40 %.

Évaluation NNS et traitement automatisé du signal numérique NNS et extraction des caractéristiques : en plus des interventions de stimulation orale (PULSED NTrainer vs sucette SHAM), tous les nourrissons de l'étude seront évalués 3 fois/semaine (par exemple, M/W/F) pour la performance NNS . Le système NTrainer sera utilisé en « mode d'évaluation » pour enregistrer la dynamique de compression du NNS au cours d'une session de 3 minutes précédant immédiatement une alimentation par sonde qui n'est pas associée à une condition d'intervention.

La période de 2 minutes la plus active du comportement NNS basée sur le nombre de cycles de succion est automatiquement extraite de chaque fichier de données d'évaluation de succion à l'aide d'un algorithme d'extraction de caractéristiques de forme d'onde automatisé sur le système NTrainer. Les pics de pression > 1,6 cm H2O sont soumis à des critères d'extraction de caractéristiques, notamment la symétrie du cycle d'aspiration, la durée du cycle et l'identification des rafales définies comme deux événements NNS ou plus se produisant en 1200 ms. Cet algorithme permet une identification objective de l'activité d'éclatement NNS distincte des compressions de mise en bouche non NNS ou des poussées de la langue contre la tétine. Quatre mesures seront extraites objectivement des enregistrements indexés de la compression d'aspiration, y compris les taux à la minute pour (1) les rafales NNS où une rafale individuelle comprend 2 cycles d'aspiration ou plus, (2) les événements de cycle NNS définis comme des cycles de compression d'aspiration avec des périodes de cycle moins supérieure à 1200 ms, (3) les compressions orales totales définies comme la somme de tous les événements de pression, et (4) la pression de compression NNS exprimée en cm H2O.

Avancement de l'alimentation PO : Les EPI avanceront selon un programme d'alimentation standardisé basé sur des signaux utilisé par chaque USIN de site, connu sous le nom de Infant Driven Feeding® qui conduira à des tétées complètes au mamelon. Cette standardisation des progrès de l'alimentation orale sur tous les sites limitera les facteurs de confusion qui pourraient finalement fausser les données.

Collecte, traitement et analyse de l'expression génique de la salive : Collecte de la salive : des échantillons de salive seront prélevés sur tous les nourrissons inscrits le premier jour avant de recevoir l'intervention SHAM ou PULSED NTrainer. Cet échantillon servira de profil d'expression génique de base. Des échantillons seront ensuite obtenus deux fois par semaine (intervalles d'environ 3 jours) jusqu'au moment de l'obtention d'une alimentation orale complète ou du retour à la maison de l'hôpital avec une sonde nasogastrique (NG) ou une sonde de gastronomie.

Des échantillons de salive sur chaque site seront collectés avec des techniques optimisées et validées par le laboratoire Maron. En bref, des échantillons de salive seront prélevés avec une seringue de 1 ml, les embouts retirés et attachés à une aspiration à paroi basse. La salive sera recueillie pendant environ 20 secondes et immédiatement stabilisée dans 500 μL de RNA Protect Saliva de Qiagen pour stopper les changements d'expression génique, inhiber les RNases destructrices et limiter la prolifération microbienne. Les échantillons seront vortexés brièvement et congelés à -20 deg C. Une fois congelés, les échantillons sont stables jusqu'à 18 mois avant qu'il soit nécessaire d'extraire l'ARN total. Ainsi, des échantillons du Nebraska et de Santa Clara seront expédiés une fois par mois sur de la glace pendant la nuit au laboratoire Maron du Mother Infant Research Institute du Tufts Medical Center à Boston, MA pour traitement.

Génération d'une biobanque de salive : un échantillon de salive supplémentaire sera obtenu chaque semaine de tous les sujets inscrits pour générer un référentiel de biobanque. La mise en banque d'un échantillon supplémentaire chaque semaine à partir des sujets de l'étude garantira que nous limiterons la perte de points de données. Nous prévoyons qu'il existe des biomarqueurs salivaires informatifs de la maturation de l'alimentation orale qui n'ont pas encore été identifiés. En générant une biobanque d'échantillons de salive supplémentaires qui peuvent être interrogés rétrospectivement sur une plate-forme d'expression génique de puce à ADN ou avec RNASeq, nous aurons le potentiel de découvrir de nouvelles hypothèses sur les interactions gène-gène et/ou les processus de régulation transcriptionnelle liés à l'alimentation orale dans le population du PEV.

Extraction d'ARN total : Les échantillons salivaires seront extraits pour l'ARN total en utilisant des protocoles établis optimisés dans le laboratoire Maron. L'extraction de l'ARN se produira avec le kit QIAGEN RNAProtect Saliva Mini conformément aux instructions du fabricant. Un traitement à la DNase sur colonne sera effectué pour chaque échantillon afin d'éliminer la contamination par l'ADN génomique. Les échantillons qui font partie de la biobanque seront congelés à -80 °C en attendant d'être analysés ultérieurement. Les échantillons qui seront utilisés pour les expériences de RT-qPCR subiront d'abord une conversion d'ADNc avec le kit Life Technologies SuperScript Vilo conformément aux instructions du fabricant. L'ADNc sera stocké à -80°C au Mother Infant Research Institute du Tufts Medical Center en attendant l'analyse de l'expression génique.

Analyse de l'expression génique : Aux fins de cette étude, nous interrogerons chaque échantillon pour neuf gènes, six gènes cibles d'intérêt et trois gènes de référence pour le contrôle de la qualité et la normalisation potentielle des données d'expression génique. Il a déjà été démontré que les gènes à analyser dans cette étude sont directement liés à l'alimentation orale chez le nouveau-né et comprennent PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK et NPHP4. Les trois gènes de référence comprennent GAPDH, HPRT1 et YWHAZ, qui ont tous démontré qu'ils maintenaient une expression génique stable tout au long de l'avancement de l'APC. Tous les échantillons d'ADNc subiront une pré-amplification ciblée avec un TaqMan® PreAmp Master Mix personnalisé pour les neuf gènes. Cette approche ciblée de l'amplification garantira que seuls les gènes d'intérêt seront amplifiés et non tous les gènes à travers le transcriptome, ce qui peut introduire un biais. L'ADNc préamplifié subira ensuite une PCR avec le Master Mix TaqMan Fast Advance sur le système de PCR en temps réel Life Technologies Quant Studio 7 Flex. Cet instrument est hébergé par le Mother Infant Research Institute du Tufts Medical Center et est une machine et un logiciel PCR à la pointe de la technologie. Tous les efforts seront faits pour respecter les lignes directrices sur les informations minimales pour la publication d'expériences quantitatives de PCR en temps réel (MIQE) pour cette étude. Tous les échantillons seront analysés en double avec les contrôles positifs et négatifs appropriés.

Analyses initiales de l'expression génique : toutes les données d'expression génique seront normalisées sur le système de PCR en temps réel Quant Studio 7 Flex. Seuls les échantillons qui ont réussi l'amplification des trois gènes de référence seront pris en compte dans l'analyse. Auparavant, les gènes étaient informatifs de manière binaire (+/- expression). Cependant, aux fins de cette étude, nous serons prêts à calculer l'expression génique relative de chaque gène cible avec la méthode du seuil de cycle delta delta (ΔΔCt). Conformément aux directives MIQE, nous utiliserons les trois gènes de référence pour la normalisation et déterminerons une moyenne géométrique de leur Ct dans chaque échantillon pour calculer l'expression relative des gènes.

Suivi neurodéveloppemental : Dans le cadre de la norme de soins, chaque site remplira les échelles de Bayley du développement du nourrisson et du tout-petit, 3e édition, sur les EPI entre 18 et 24 mois d'âge corrigé (CA). Les principaux sous-tests d'intérêt comprennent la motricité fine, la motricité globale, la cognition et le langage. Ces données seront enregistrées, analysées et corrélées avec les résultats de l'alimentation pendant la période néonatale et postnatale, les données sur l'expression génique et le statut de l'intervention. De plus, les paramètres de croissance, y compris la circonférence de la tête, la longueur et le poids, seront enregistrés.