Somatosensorisk modulering av salivgenuttryck och oral matning hos prematura spädbarn

Syftet med denna studie är att kombinera molekylära och beteendemässiga metoder i en experimentell konceptualiseringsmetod för att kartlägga effekterna av trigeminus (PULSED orokutan) somatosensorisk stimulering på salivgenuttryck i samband med förvärvet av en utsökt komplex oromotorisk färdighet, nämligen oral matning, hos nyfödda människor med hög risk. Syften med denna studie representerar det första försöket att kombinera icke-invasiva behandlingsstrategier och transkriptomiska bedömningar av högrisk-EPI för att (1) förbättra oralt matningsbeteende och färdigheter, (2) främja vår förståelse av genontologin för biologiskt olika vägar relaterade. till oral utfodring, (3) använda genuttrycksdata för att personifiera neonatalvård och individualisera behandlingsstrategier och timing av interventioner, och (4) förbättra långsiktiga utvecklingsresultat. Denna integrerande metod för oral matning är ett paradigmskifte inom neonatalvård där snabbt framväxande tekniska framsteg och personlig transkriptomi säkert och icke-invasivt kan föras till neonatalsängen för att informera medicinska vårdbeslut och förbättra vård och resultat.

Metoder Deltagare: Endast EPI födda mellan 24 0/7 och 28 6/7 veckors graviditet, fastställd av obstetrisk ultraljud vid < 15 veckor eller senaste menstruation, är berättigade att delta i denna studie. Vi kommer aktivt att registrera EPI när de har en korrigerad PCA på ≥ 29 veckor för att begränsa antalet spädbarn som utvecklar allvarliga följdsjukdomar av prematuritet och som inte skulle vara berättigade till denna studie baserat på kriterierna nedan. Föräldrar till inskrivna försökspersoner kommer att få ett presentkort på 50 USD för Babies R Us för sitt deltagande. Försökspersoner kommer att rekryteras från fyra neonatala intensivvårdsenheter inklusive 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], och 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] av en PI/Co-Investigator eller den neonatala studiekoordinatorn. Informerat samtycke kommer att erhållas innan deltagarna går in i studien, efter samråd med den behandlande läkaren och sjuksköterskan. Totalt 180 EPI (ungefär lika antal män och kvinnor, ingen uteslutning baserat på ras/etnicitet) kommer att delta i studien (styrka >.85, typ I-fel <.05).

Uteslutningskriterier: EPI:er kommer inte att rekryteras för denna studie om de har något av följande: 1) kromosomala och medfödda anomalier inklusive kraniofacial missbildning, anomalier i nervsystemet, cyanotisk medfödd hjärtsjukdom, gastroschisis, omphalocele, diafragmabråck och/eller andra stora gastrointestinala sjukdomar anomalier; 2) medfödd infektion, 3) ingen dokumenterad GA, 4) svår IUGR (3%), 5) onormalt neurologiskt tillstånd inklusive huvudomkrets < 10:e eller > 90:e percentilen, intrakraniell blödning grad III och IV, kramper, meningit, neurologisk undersökning som visar onormalt tonus eller rörelser av alla extremiteter för PCA; 6) historia av nekrotiserande enterokolit (stadium II och III); och, 7) kulturpositiv sepsis vid tidpunkten för studieregistrering.

Protokoll: EPI kommer att stratifieras i två graviditetsåldersgrupper (24 0/7 - 26 6/7 veckor och 27 0/7 - 28 6/7 veckor). Varje spädbarn kommer att randomiseras för att få antingen PULSED NTrainer- eller SHAM-interventionen med hjälp av en slumpmässig heltalsfunktion i programvaran i Minitab v.17 (www.minitab.com). Spädbarn som tilldelats gruppen PULSED NTrainer kommer att få en progressiv dos av den pulserande orokutana stimuleringen. Från och med 30 veckors PCA kommer dessa spädbarn att få 2 veckors lågdos PULSED NTrainer-stimulering (2 x 3-minutersblock) med en 1-minuters stimulans "off-period" mellan stimuleringsblocken. Denna form av stimulering kommer att ges samtidigt med sondmatning 3 gånger/dag. Stimulusdosen kommer sedan att ökas under de kommande 2 veckorna (3 x 3-minuters block av PULSED NTrainer-stimulering) med en 1-minuters stimulans "off-period" mellan stimuleringsblocken, även ges samtidigt med sondmatning 3 gånger/dag . EPI:er randomiserade till SHAM-tillståndet kommer att ges en vanlig silikonnapp under sondmatning under samma tidsperiod.

En viloperiod på 1 minut (ingen stimulering) sker mellan stimuleringsblocken. Kriterier för initiering av orokutan terapi inkluderar följande: 1) stabila vitala tecken och inte på kontinuerliga vasopressormediciner; 2) tolerera enteral matning under föregående 48 timmar; och 3) inte intuberad och mekaniskt ventilerad. Om barnet har intermittent övertrycksventilation i näsan, kontinuerligt positivt luftvägstryck eller näskanyl >2 liter per minut, måste FiO2 vara <40 %.

NNS Assessment och Automatiserad NNS Digital Signal Processing och Feature Extraction: Förutom de orala stimuleringsinterventionerna (PULSED NTrainer vs. SHAM-napp), kommer alla studiespädbarn att bedömas 3 gånger/vecka (t.ex. M/V/F) för NNS-prestanda . NTrainer-systemet kommer att användas i "bedömningsläge" för att registrera kompressionsdynamiken för NNS under en 3-minuters session för att omedelbart föregå en sondmatning som inte är associerad med ett interventionstillstånd.

Den mest aktiva 2-minutersperioden av NNS-beteende baserat på sugcykelräkning extraheras automatiskt från varje sugbedömningsdatafil med hjälp av en automatisk vågformsfunktionsextraktionsalgoritm på NTrainer-systemet. Trycktoppar > 1,6 cm H2O utsätts för funktionsextraktionskriterier, inklusive sugcykelsymmetri, cykellängd och burstidentifiering definierade som två eller flera NNS-händelser som inträffar inom 1200 ms. Denna algoritm tillåter objektiv identifiering av NNS-burst-aktivitet skild från icke-NNS-munkompressioner eller tungstötningar mot nappen. Fyra mått kommer objektivt att extraheras från de indexerade registreringarna av sugkompression, inklusive minuthastigheter för (1) NNS-skurar där en enskild skur inkluderar 2 eller fler sugcykler, (2) NNS-cykelhändelser definierade som sugkompressionscykler med mindre cykelperioder än 1200 ms, (3) Totala orala kompressioner definierade som summan av alla tryckhändelser och (4) NNS-kompressionstryck uttryckt i cm H2O.

PO-matningsavancemang: EPI:er kommer att avancera på ett standardiserat cue-baserat matningsschema som används av varje NICU på platsen, känd som Infant Driven Feeding® som kommer att leda till full bröstvårtor. Denna standardisering av framsteg i oral matning över webbplatser kommer att begränsa konfounders som i slutändan kan skeva data.

Salivinsamling, bearbetning och genuttrycksanalys: Salivinsamling: Salivprover kommer att samlas in från alla inskrivna spädbarn den första dagen innan de får antingen SHAM- eller PULSED NTrainer-interventionen. Detta prov kommer att fungera som vår baslinjegenexpressionsprofil. Prover kommer sedan att tas två gånger per vecka (~ 3 dagars intervall) fram till tidpunkten för uppnående av full oral matning eller utskrivning hem från sjukhuset med antingen en nasogastrisk sond (NG) eller gastronomisond.

Salivprover på varje plats kommer att samlas in med tekniker som har optimerats och validerats genom Maron-laboratoriet. Kortfattat kommer salivprover att samlas in med en 1 ml spruta, ändlocken tas bort och fästs på lågväggssug. Saliv kommer att samlas in i cirka 20 sekunder och omedelbart stabiliseras i 500 μL av Qiagens RNA Protect Saliv för att stoppa genuttrycksförändringar, hämma destruktiva RNaser och begränsa mikrobiell överväxt. Proverna ska vortexas kort och frysas vid -20 grader C. När de väl har frysts är proverna stabila i upp till 18 månader innan det behövs total RNA-extraktion. Således kommer prover från Nebraska och Santa Clara att skickas en gång i månaden på is över natten till Maron-laboratoriet vid Mother Infant Research Institute vid Tufts Medical Center i Boston, MA för bearbetning.

Generering av en salivbiobank: Ett ytterligare salivprov kommer att tas varje vecka från alla inskrivna försökspersoner för att skapa ett biobanksförråd. Att ta ett extra prov varje vecka från studiepersoner kommer att säkerställa att vi kommer att begränsa förlusten av datapunkter. Vi räknar med att det finns informativa salivbiomarkörer för oral matmognad som ännu inte har identifierats. Genom att generera en biobank med ytterligare salivprover som kan förhöras i efterhand på antingen en mikroarray-genuttrycksplattform eller med RNASeq, kommer vi att ha potential att upptäcka nya hypoteser om gen-geninteraktioner och/eller transkriptionella regleringsprocesser relaterade till oral matning i EPI-population.

Total RNA-extraktion: Salivprover kommer att extraheras för totalt RNA med hjälp av etablerade protokoll optimerade i Maron-laboratoriet. RNA-extraktion kommer att ske med QIAGEN RNAProtect Saliva Mini-kit enligt tillverkarens instruktioner. På kolumn kommer DNas-behandling att utföras för varje prov för att eliminera genomisk DNA-kontamination. Prover som ingår i biobanken kommer att frysas vid -80°C i avvaktan på behov för framtida analys. Prover som kommer att användas för RT-qPCR-experiment kommer först att genomgå cDNA-konvertering med Life Technologies SuperScript Vilo kit enligt tillverkarens instruktioner. cDNA kommer att lagras vid -80°C i Mother Infant Research Institute vid Tufts Medical Center i väntan på genuttrycksanalys.

Genuttrycksanalys: I syftet med denna studie kommer vi att förhöra varje prov för nio gener, sex målgener av intresse och tre referensgener för kvalitetskontroll och potentiell normalisering av genuttrycksdata. Gener som ska analyseras i denna studie har tidigare visat sig vara direkt kopplade till oral matning hos nyfödda och inkluderar PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK och NPHP4. De tre referensgenerna inkluderar GAPDH, HPRT1 och YWHAZ, som alla har visat sig bibehålla stabilt genuttryck över framskridande PCA. Alla cDNA-prover kommer att genomgå en riktad pre-amplifiering med en anpassad TaqMan® PreAmp Master Mix för alla nio gener. Detta målinriktade tillvägagångssätt för amplifiering kommer att säkerställa att endast de gener av intresse kommer att amplifieras och inte alla gener över transkriptomen som kan introducera bias. Förförstärkt cDNA kommer sedan att genomgå PCR med TaqMan Fast Advance Master Mix på Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Detta instrument är inrymt hos Mother Infant Research Institute vid Tufts Medical Center och är en avancerad, toppmodern PCR-maskin och mjukvarusystem. Alla ansträngningar kommer att göras för att följa riktlinjerna för minimiinformation för publicering av kvantitativa realtids-PCR-experiment (MIQE) för denna studie. Alla prover kommer att köras i duplikat med lämpliga positiva och negativa kontroller.

Initiala genuttrycksanalyser: Alla genuttrycksdata kommer att normaliseras på Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR System. Endast prover som har framgångsrik amplifiering av alla tre referensgener kommer att beaktas i analysen. Tidigare har gener varit informativa på ett binärt sätt (+/- uttryck). Men för syftet med denna studie kommer vi att vara beredda att beräkna relativ genuttryck för varje målgen med delta delta cykel tröskel (ΔΔCt) metoden. I enlighet med MIQE-riktlinjerna kommer vi att använda de tre referensgenerna för normalisering och bestämma ett geometriskt medelvärde av deras Ct i varje prov för att beräkna det relativa genuttrycket.

Neuroutvecklingsuppföljning: Som en del av standardvården kommer varje plats att slutföra Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Edition, på EPI vid 18 till 24 månaders korrigerad ålder (CA). De primära deltesterna av intresse inkluderar finmotorik, grovmotorik, kognition och språk. Dessa data kommer att registreras, analyseras och korreleras med utfodringsresultat under neo- och postnatalperioden, genuttrycksdata och interventionsstatus. Dessutom kommer tillväxtparametrar inklusive huvudomkrets, längd och vikt att registreras.