Sylkigeenin ilmentymisen somatosensorinen modulaatio ja oraalinen ruokinta keskosilla

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on yhdistää molekyyli- ja käyttäytymismenetelmiä kokeellisessa käsitteellistämislähestymistavassa, jolla kartoitetaan trigeminaalisen (PULSED-orokutaanisen) somatosensorisen stimulaation vaikutukset syljen geenin ilmentymiseen, kun hankitaan erittäin monimutkainen oromotorinen taito, nimittäin suun kautta tapahtuva ruokinta. riskialttiilla vastasyntyneillä. Tämän tutkimuksen tavoitteet edustavat ensimmäistä yritystä yhdistää ei-invasiivisia hoitostrategioita ja korkean riskin EPI:iden transkriptomisia arviointeja (1) parantaakseen suun ruokintakäyttäytymistä ja -taitoja, (2) parantaaksemme ymmärrystämme biologisesti monimuotoisten reittien geeniontologiasta. suun kautta ruokintaan, (3) käyttää geenien ilmentymisdataa vastasyntyneiden hoidon personointiin ja hoitostrategioiden ja ajoitustoimenpiteiden yksilöimiseen ja (4) parantaa pitkän aikavälin kehitystuloksia. Tämä integroiva lähestymistapa suun kautta tapahtuvaan ruokintaan on paradigman muutos vastasyntyneiden hoidossa, jossa nopeasti kehittyvä teknologinen kehitys ja henkilökohtainen transkriptiikka voidaan turvallisesti ja ei-invasiivisesti tuoda vastasyntyneiden hoitoon vaikuttamaan lääketieteellisiin hoitopäätöksiin ja parantamaan hoitoa ja tuloksia.

Menetelmät Osallistujat: Tähän tutkimukseen voivat osallistua vain 24 0/7 ja 28 6/7 raskausviikon välisenä aikana syntyneet EPI:t, jotka on määritetty synnytysultraäänellä alle 15 viikon tai viimeisten kuukautisten aikana. Rekisteröimme aktiivisesti EPI-lääkkeitä, kun niillä on korjattu PCA ≥ 29 viikkoa rajoittaaksemme niiden imeväisten määrää, joille kehittyy vakavia ennenaikaisuuden jälkitauteja ja jotka eivät olisi kelvollisia tähän tutkimukseen alla lueteltujen kriteerien perusteella. Ilmoittautuneiden koehenkilöiden vanhemmat saavat osallistumisestaan ​​Babies R Us 50 dollarin lahjakortin. Tutkittavat rekrytoidaan neljästä vastasyntyneiden tehohoitoyksiköstä, mukaan lukien 1) CHI Health St. Elizabeth [Lincoln, NE], 2) Tufts Medical Center NICU [Boston, MA], 3) Santa Clara Valley Medical Center [San Jose, CA], ja 4) Childrens Hospital Orange Country [Los Angeles, CA] tutkimuspaikan PI/Co-Investigator tai vastasyntyneiden tutkimuksen koordinaattorin toimesta. Tietoinen suostumus hankitaan ennen osallistujien osallistumista tutkimukseen hoitavaa lääkäriä ja sairaanhoitajaa kuultuaan. Tutkimukseen osallistuu yhteensä 180 EPI:tä (noin yhtä suuri määrä miehiä ja naisia, ei rotuun/etniseen alkuperään perustuvaa poissulkemista) (teho >,85, tyypin I virhe <,05).

Poissulkemiskriteerit: EPI:itä ei oteta mukaan tähän tutkimukseen, jos heillä on jokin seuraavista: 1) kromosomi- ja synnynnäiset poikkeavuudet, mukaan lukien kallon epämuodostumat, hermoston poikkeavuudet, syanoottinen synnynnäinen sydänsairaus, gastroskiisi, omfalokele, palleatyrä ja/tai muut suuret maha-suolikanavan sairaudet. poikkeavuuksia; 2) synnynnäinen infektio, 3) ei dokumentoitua GA:ta, 4) vakava IUGR (3 %), 5) epänormaali neurologinen tila, mukaan lukien pään ympärysmitta < 10. tai > 90. persentiili, kallonsisäinen verenvuoto, asteet III ja IV, kohtaukset, aivokalvontulehdus, neurologinen tutkimus, joka osoittaa epänormaalia kaikkien raajojen sävy tai liikkeet PCA:ta varten; 6) aiempi nekrotisoiva enterokoliitti (vaihe II ja III); ja 7) viljelypositiivinen sepsis tutkimukseen ilmoittautumishetkellä.

Protokolla: EPI:t jaetaan kahteen raskausikäryhmään (24 0/7 - 26 6/7 viikkoa ja 27 0/7 - 28 6/7 viikkoa). Jokainen lapsi satunnaistetaan vastaanottamaan joko PULSED NTrainer- tai SHAM-interventio käyttäen ohjelmiston satunnaista kokonaislukutoimintoa Minitab v.17:ssä (www.minitab.com). PULSED NTrainer -ryhmään kuuluvat lapset saavat progressiivisen annoksen sykkivää orikutaanistimulaatiota. Alkaen 30 viikon PCA:sta, nämä lapset saavat 2 viikkoa pieniannoksista PULSED NTrainer -stimulaatiota (2 x 3 minuutin lohkoa) ja 1 minuutin ärsykkeen "off-jakso" stimulaatiolohkojen välillä. Tämä stimulaatiomuoto annetaan samanaikaisesti letkuruokinnan kanssa 3 kertaa päivässä. Sen jälkeen ärsykeannosta nostetaan seuraavien 2 viikon aikana (3 x 3 minuutin jakso PULSED NTrainer -stimulaatiota) stimulaatiolohkojen välissä 1 minuutin ärsykkeen "off-jaksolla", joka annetaan myös samanaikaisesti letkuruokinnan kanssa 3 kertaa päivässä. . SHAM-tilaan satunnaistetuille EPI:ille annetaan tavallinen silikonitutti letkuruokinnan aikana saman ajanjakson aikana.

Stimulaatiolohkojen välillä on 1 minuutin lepoaika (ei stimulaatiota). Orikutaanisen hoidon aloittamisen kriteerejä ovat seuraavat: 1) vakaat elintoiminnot, ei jatkuvalla vasopressorilääkkeillä; 2) sietää enteraalisia syötteitä edellisten 48 tunnin aikana; ja 3) ei intuboitu ja koneellisesti tuuletettu. Jos vauva on nenän jaksottaisessa ylipaineventilaatiossa, jatkuvassa ylipainehengitystilassa tai nenäkanyylissä >2 litraa minuutissa, FiO2:n tulee olla <40 %.

NNS-arviointi ja automaattinen NNS-digitaalisignaalin käsittely ja ominaisuuksien erottaminen: Suun kautta suoritettavien stimulaatiotoimenpiteiden (PULSED NTrainer vs. SHAM-tutti) lisäksi kaikkien tutkimuslasten NNS-suorituskykyä arvioidaan 3 kertaa viikossa (esim. M/W/F). . NTrainer-järjestelmää käytetään "arviointitilassa" NNS:n puristusdynamiikan tallentamiseen 3 minuutin istunnon aikana välittömästi ennen putkensyöttöä, joka ei liity interventiotilaan.

Aktiivisin 2 minuutin jakso NNS-käyttäytymisestä, joka perustuu imemisjaksojen määrään, poimitaan automaattisesti jokaisesta imemisarviointitiedostosta käyttämällä NTrainer-järjestelmän automaattista aaltomuotopiirteiden poiminta-algoritmia. Painehuippuihin > 1,6 cm H2O sovelletaan piirteiden erotuskriteerejä, mukaan lukien imusyklin symmetria, syklin kesto ja purskeen tunnistaminen, jotka määritellään kahdeksi tai useammaksi NNS-tapahtumaksi, jotka tapahtuvat 1200 ms:n sisällä. Tämä algoritmi mahdollistaa NNS-purskeaktiviteetin objektiivisen tunnistamisen, joka eroaa ei-NNS-suussa tapahtuvista puristamisesta tai kielen työntöstä tuttia vasten. Neljä mittaa erotetaan objektiivisesti imupakkauksen indeksoiduista tietueista, mukaan lukien minuuttinopeudet (1) NNS-purskeille, joissa yksittäinen purske sisältää 2 tai useampia imujaksoja, (2) NNS-jaksotapahtumat, jotka määritellään imupakkausjaksoiksi, joiden jaksojaksot ovat lyhyempiä. yli 1 200 ms, (3) Oraaliset kokonaispuristukset, jotka määritellään kaikkien painetapahtumien summana, ja (4) NNS-puristuspaine ilmaistuna cm H2O:na.

PO Feeding Advancement: EPI:t etenevät standardoidun vihjepohjaisen ruokinta-aikataulun mukaisesti, jota jokainen NICU käyttää, joka tunnetaan nimellä Infant Driven Feeding®, joka johtaa täyden nännin syöttämiseen. Tämä suullisen ruokinnan edistymisen standardointi eri sivustoilla rajoittaa sekaannuksia, jotka voivat lopulta vääristää tietoja.

Syljen kerääminen, käsittely ja geeniekspressioanalyysi: Sylkikeräys: Sylkinäytteet otetaan kaikilta ilmoittautuneilta imeväisiltä ensimmäisenä päivänä ennen joko SHAM- tai PULSED NTrainer -hoitoa. Tämä näyte toimii perustason geeniekspressioprofiilinamme. Näytteitä otetaan sitten kahdesti viikossa (noin 3 päivän välein) siihen asti, kun täysi oraalinen ruokinta saavutetaan tai kotiutetaan sairaalasta joko nenämahaletkulla (NG) tai gastronomialetkulla.

Sylkinäytteet otetaan kustakin paikasta tekniikoilla, jotka on optimoitu ja validoitu Maron-laboratorion kautta. Lyhyesti sanottuna sylkinäytteet kerätään 1 ml:n ruiskulla, päätytulpat poistetaan ja kiinnitetään matalaan seinään. Sylkeä kerätään noin 20 sekunnin ajan ja stabiloidaan välittömästi 500 µl:ssa Qiagenin RNA Protect Salivaa geenien ilmentymisen muutosten pysäyttämiseksi, tuhoavien RNaasien estämiseksi ja mikrobien liikakasvun rajoittamiseksi. Näytteitä vorteksoidaan lyhyesti ja pakastetaan -20 °C:seen. Kun näytteet on jäädytetty, ne ovat stabiileja jopa 18 kuukautta ennen kuin tarvitaan RNA:n kokonaisuutto. Siten Nebraskasta ja Santa Clarasta peräisin olevat näytteet lähetetään kerran kuukaudessa jäällä yön yli Maronin laboratorioon Mother Infant Research Institutessa Tufts Medical Centerissä Bostonissa, MA:ssa käsiteltäväksi.

Sylkibiopankin luominen: Kaikilta ilmoittautuneilta koehenkilöiltä otetaan joka viikko yksi ylimääräinen sylkinäyte biopankkiarkiston luomiseksi. Pankkimalla joka viikko lisänäytteen tutkimusaineista varmistamme, että datapisteiden häviäminen rajoitetaan. Odotamme, että on olemassa informatiivisia syljen biomarkkereita suun ruokinnan kypsymisestä, joita ei ole vielä tunnistettu. Luomalla biopankin lisäsylkinäytteistä, joita voidaan tutkia takautuvasti joko microarray-geenin ilmentämisalustalla tai RNASeq:llä, voimme löytää uusia hypoteeseja geenien ja geenin vuorovaikutuksista ja/tai transkription säätelyprosesseista, jotka liittyvät suun kautta tapahtuvaan ruokintaan. EPI-populaatio.

RNA:n kokonaisuutto: Sylkinäytteet uutetaan kokonais-RNA:ta varten vakiintuneiden Maron-laboratoriossa optimoitujen protokollien mukaisesti. RNA:n uuttaminen tapahtuu QIAGEN RNAProtect Saliva Mini -sarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kolonnissa DNaasi-käsittely suoritetaan jokaiselle näytteelle genomisen DNA-kontaminaation poistamiseksi. Biopankkiin kuuluvat näytteet jäädytetään -80°C:een odotettaessa tulevaa analyysia. Näytteille, joita käytetään RT-qPCR-kokeissa, tehdään ensin cDNA-muunnos Life Technologies SuperScript Vilo -sarjalla valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA:ta säilytetään -80 °C:ssa Mother Infant Research Institutessa Tufts Medical Centerissä geeniekspressioanalyysiä odotettaessa.

Geeniekspressioanalyysi: Tätä tutkimusta varten tutkimme jokaista näytettä yhdeksän geenin, kuuden kiinnostavan kohdegeenin ja kolmen vertailugeenin osalta laadunvalvontaa ja geeniekspressiotietojen mahdollista normalisointia varten. Tässä tutkimuksessa analysoitavien geenien on aiemmin osoitettu olevan suoraan yhteydessä vastasyntyneen suun kautta tapahtuvaan ruokintaan, ja niihin kuuluvat PLXNA1, PLXNA3, NPY2R, WNT3, AMPK ja NPHP4. Kolme vertailugeeniä sisältävät GAPDH:n, HPRT1:n ja YWHAZ:n, joiden kaikkien on osoitettu ylläpitävän vakaata geeniekspressiota etenevän PCA:n aikana. Kaikille cDNA-näytteille tehdään kohdennettu esimonistus mukautetulla TaqMan® PreAmp Master Mixillä kaikille yhdeksälle geenille. Tämä kohdennettu lähestymistapa amplifikaatioon varmistaa, että vain ne kiinnostavat geenit monistuvat, eivätkä kaikki transkriptomissa olevat geenit, jotka voivat aiheuttaa harhaa. Esivahvistetulle cDNA:lle suoritetaan sitten PCR ja TaqMan Fast Advance Master Mix Life Technologies Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR -järjestelmässä. Tämä instrumentti sijaitsee Mother Infant Research Institutessa Tufts Medical Centerissä, ja se on edistynyt huippuluokan PCR-kone ja ohjelmistojärjestelmä. Tämän tutkimuksen osalta pyritään noudattamaan vähimmäistietoja kvantitatiivisten reaaliaikaisten PCR-kokeiden julkaisemista varten (MIQE). Kaikki näytteet ajetaan kahtena rinnakkaisena asianmukaisten positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa.

Alkuperäiset geeniekspressio-analyysit: Kaikki geenin ilmentymistiedot normalisoidaan Quant Studio 7 Flex Real-Time PCR -järjestelmässä. Vain näytteet, joiden kaikkien kolmen vertailugeenin monistuminen on onnistunut, otetaan huomioon analyysissä. Aikaisemmin geenit ovat olleet informatiivisia binäärimuodossa (+/- ilmentymä). Tätä tutkimusta varten olemme kuitenkin valmiita laskemaan kunkin kohdegeenin suhteellisen geeniekspression delta-deltasyklin kynnys (ΔΔCt) -menetelmällä. MIQE-ohjeiden mukaisesti käytämme kolmea vertailugeeniä normalisointiin ja määritämme niiden Ct:n geometrisen keskiarvon kussakin näytteessä suhteellisen geeniekspression laskemiseksi.

Neurokehityksen seuranta: Osana tavanomaista hoitoa jokainen paikka täydentää Bayley Scales of Infant and Toddler Development 3rd Editionin EPI:illä 18–24 kuukauden korjatussa iässä (CA). Ensisijaisia ​​kiinnostavia osatestejä ovat hienomoottori, bruttomoottori, kognitio ja kieli. Nämä tiedot tallennetaan, analysoidaan ja korreloidaan ruokintatulosten kanssa vastasyntyneen ja synnytyksen jälkeisellä kaudella, geenien ilmentymistietoihin ja interventiotilaan. Lisäksi tallennetaan kasvuparametrit, mukaan lukien pään ympärysmitta, pituus ja paino.