ヒトにおける細胞代謝のインビボ評価

トリカルボン酸 (TCA) またはクレブス サイクルは、ミトコンドリア内で行われる「細胞代謝の中心ハブ」です。 これは、ATP の形で細胞エネルギーを生成する一連の連続した化学反応です。 さらに、このサイクルは、アミノ酸と脂肪酸の生合成に利用される中間代謝産物、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NADH) やフラビンアデニンジヌクレオチド (FADH2) などの還元剤を提供し、これらは多くの生化学反応で使用されます。 TCA サイクルの機能不全は、神経変性疾患や心血管疾患、メタボリック シンドローム、腫瘍形成、老化との関連性が認められています。 したがって、in vitro または in vivo のいずれかで TCA サイクルの活性またはフラックスを測定できることは、重要な臨床的意義を保持しています。 ほとんどすべての研究は、複数の検証されていない仮定を含む NMRS ベースの研究を除いて、in vitro アプローチに基づいています。

さまざまな安定同位体標識研究が使用され、サイクル内の 1 つまたは複数の標識された中間代謝物を測定することにより、TCA サイクルフラックスが推定されています。 残念なことに、これらの標識された中間体は、交換、アナプレローシス (サイクルへの入り口)、カタプレローシス (サイクルからの排出)、または不完全なサイクリングのために、サイクルの部分的なセグメントのみに存在することがよくあります。 TCAサイクルフラックスのこれらの以前の同位体標識研究は定性的に有益でしたが、標識されていない前駆体から生じるTCAサイクル中間体の予想外の希釈のために、多くは定量的に不正確でした.

これは、2-13C-アセテート、2-15N-グルタミン、および D5-フェニルアラニンの注入後に質量アイソトポマー フラックス分析を使用して、ヒトの組織における in vivo TCA サイクル フラックスを測定する新しい方法論を確立するためのパイロット研究です。 この研究は、特定の組織床の動脈血供給と静脈血供給の間の標識されたTCAサイクル中間体の濃縮の動的な違いを通じて間接的に組織内のTCAサイクルフラックスを測定することの妥当性を同時に決定します（すなわち 動静脈モデルまたは A-V バランス技術)。 TCA サイクル全体の酸化、補充、カタプレロシス、および交換速度を特徴付けるために、中間代謝産物間の位置特異的な 13C および 15N 移動を追跡することにより、TCA サイクル内のさまざまな代謝反応の速度を測定することを提案します。 2-15N-グルタミンを使用すると、グルタミン酸への変換を介してグルタミンがサイクルに入る速度を特定できるため、TCA フラックスのより正確な定量化が可能になります。

この方法論は、低内因性インスリンレベル単独または高グルカゴンレベルとの組み合わせなど、人間の研究参加者における制御された生理学的摂動の設定で検証されます。

最後に、骨格筋組織におけるミトコンドリア活性、骨格および内臓組織床の酸素消費量、骨格および内臓組織床の動静脈循環に由来する循環エキソソームの役割、および全身メタボロームの変化を評価する相関研究も実行されます:

• まず、ミトコンドリアの呼吸は、電子伝達系のさまざまなコンポーネントを評価するための段階的なプロトコルを使用して、高解像度の呼吸測定 (Oxygraph、Oroboros Instruments、インスブルック、オーストリア) によって測定されます。 ミトコンドリア懸濁液のタンパク質含有量は、比色アッセイ（Pierce 660-nm Protein Assay）を使用して測定されます。 酸素フラックス率は、組織湿重量あたり、およびミトコンドリアタンパク質のミリグラムあたりで表されます。
• 第二に、活性酸素種 (ROS) の放出も、すべての骨格筋組織サンプルで評価されます。 簡単に言えば、温度制御と連続攪拌を備えた Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) 分光蛍光光度計を使用して、骨格筋生検から得られた新鮮なミトコンドリア懸濁液中の Amplex Red (Invitrogen) 酸化を監視します。 Amplex Red 酸化は、グルタミン酸 (10 mmol/L)、リンゴ酸 (2 mmol/L)、およびコハク酸 (10 mmol/L) の存在下で測定されます。 蛍光シグナルは、バックグラウンドの自動酸化に対して補正され、標準曲線に対して較正されます。 H2O2 生成率は、ミトコンドリアタンパク質と比較して表されます。
• 第三に、酸素消費量と二酸化炭素生成量の同時評価は、内臓および骨格筋組織床から得られた動静脈サンプルからの血液ガス測定によって決定されます。 これらの評価は、血液サンプル評価の 3 つの時点すべてで実行され、それぞれの組織床で測定された TCA サイクル フラックスと相関します。
• 循環エキソソームは、内臓および骨格筋組織床の動静脈サンプルからも導出され、そのエキソソーム内プロテオームおよびメタボローム、ならびにそれぞれの組織床における TCA サイクルフラックスとの関係が決定されます。 D5-フェニルアラニンの取り込みは、エキソソームでのタンパク質形成の追跡に役立ちます。
• 最後に、内臓および骨格筋の組織床から得られた動静脈サンプルを介して決定される全身メタボロームおよびプロテオームの変化も実行され、それぞれの組織床の TCA サイクルフラックスと相関します。