In-vivo-Bewertung des Zellstoffwechsels beim Menschen

Der Tricarbonsäure- (TCA) oder Krebs-Zyklus ist die „zentrale Drehscheibe des Zellstoffwechsels“, der in den Mitochondrien stattfindet. Es ist eine Reihe aufeinanderfolgender chemischer Reaktionen, die Zellenergie in Form von ATP erzeugen. Darüber hinaus liefert der Zyklus intermediäre Metaboliten, die bei der Biosynthese von Aminosäuren und Fettsäuren verwendet werden, sowie Reduktionsmittel wie Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2), die in zahlreichen biochemischen Reaktionen verwendet werden. Die Dysfunktion des TCA-Zyklus ist bekannt für ihre Assoziation mit neurodegenerativen und kardiovaskulären Erkrankungen, metabolischen Syndromen, Tumorentstehung und Alterung. Daher ist es von großer klinischer Bedeutung, die Aktivität oder den Fluss des TCA-Zyklus entweder in vitro oder in vivo messen zu können. Fast alle Studien basieren auf In-vitro-Ansätzen, mit Ausnahme von NMRS-basierten Studien, die mehrere nicht validierte Annahmen beinhalten.

Verschiedene Markierungsstudien mit stabilen Isotopen wurden verwendet, um den Fluss des TCA-Zyklus abzuschätzen, indem ein oder mehrere markierte Zwischenmetabolite innerhalb des Zyklus gemessen wurden. Leider sind diese markierten Zwischenprodukte aufgrund von Austausch, Anaplerose (Eintritt in den Kreislauf), Kataplerose (Ausfuhr aus dem Kreislauf) oder unvollständigem Kreislauf häufig nur in Teilsegmenten des Zyklus vorhanden. Obwohl diese früheren Isotopenmarkierungsstudien des Flusses des TCA-Zyklus qualitativ informativ waren, waren viele quantitativ ungenau aufgrund unerwarteter Verdünnungen der Zwischenprodukte des TCA-Zyklus, die von unmarkierten Vorläufern herrühren.

Dies ist eine Pilotstudie zur Etablierung einer neuartigen Methodik unter Verwendung der Massen-Isotopomer-Flussanalyse nach Infusionen von 2-13C-Acetat, 2-15N-Glutamin und D5-Phenylalanin zur Messung des In-vivo-TCA-Zyklusflusses in Geweben von Menschen. Diese Studie wird gleichzeitig die Gültigkeit der indirekten Messung des Flusses des TCA-Zyklus im Gewebe durch dynamische Unterschiede in der Anreicherung von markierten TCA-Zyklus-Zwischenprodukten zwischen arteriellen und venösen Blutversorgungen dieses bestimmten Gewebebetts (d. h. arteriovenöses Modell oder AV-Balance-Technik). Wir schlagen vor, die Raten der verschiedenen Stoffwechselreaktionen innerhalb des TCA-Zyklus zu messen, indem wir den positionsspezifischen 13C- und 15N-Transfer zwischen den intermediären Metaboliten verfolgen, um die oxidativen, anaplerotischen, kataplerotischen und Austauschraten über den TCA-Zyklus hinweg zu charakterisieren. Die Verwendung von 2-15N-Glutamin ermöglicht es uns insbesondere, die Geschwindigkeit des Glutamineintritts in den Zyklus über seine Umwandlung in Glutamat zu bestimmen, wodurch eine genauere Quantifizierung des TCA-Flusses ermöglicht wird.

Diese Methodik wird im Zusammenhang mit kontrollierten physiologischen Störungen bei menschlichen Studienteilnehmern wie niedrigen endogenen Insulinspiegeln allein oder in Kombination mit hohen Glukagonspiegeln validiert.

Schließlich korrelative Studien zur Bewertung der mitochondrialen Aktivität im Skelettmuskelgewebe, des Sauerstoffverbrauchs im Skelett- und Splanchnikusgewebe, der Rolle zirkulierender Exosomen, die aus der arteriovenösen Zirkulation des Skelett- und Splanchnikusgewebes stammen, und der Veränderungen im Metabolom des gesamten Körpers werden auch durchgeführt:

• Zuerst wird die mitochondriale Atmung durch hochauflösende Respirometrie (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich) gemessen, wobei ein schrittweises Protokoll verwendet wird, um verschiedene Komponenten des Elektronentransportsystems zu bewerten. Der Proteingehalt der mitochondrialen Suspension wird mit einem kolorimetrischen Assay (Pierce 660-nm Protein Assay) gemessen. Die Sauerstoffflussraten werden pro Gewebefeuchtgewicht und pro Milligramm mitochondriales Protein ausgedrückt.
• Zweitens werden die Emissionen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auch bei allen Skelettmuskelgewebeproben bewertet. Kurz gesagt wird ein Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) Spektrofluorometer mit Temperaturkontrolle und kontinuierlichem Rühren verwendet, um die Oxidation von Amplex Red (Invitrogen) in frisch isolierten mitochondrialen Suspensionen zu überwachen, die aus den Skelettmuskelbiopsien erhalten wurden. Die Oxidation von Amplex Red wird in Gegenwart von Glutamat (10 mmol/L), Malat (2 mmol/L) und Succinat (10 mmol/L) gemessen. Das Fluoreszenzsignal wird auf Hintergrund-Autooxidation korrigiert und auf eine Standardkurve kalibriert. Die H2O2-Produktionsraten werden relativ zum mitochondrialen Protein ausgedrückt.
• Drittens werden simultane Bewertungen des Sauerstoffverbrauchs und der Kohlendioxidproduktion durch Blutgasmessungen aus den arteriovenösen Proben bestimmt, die aus den Splanchnikus- und Skelettmuskelgewebebetten gewonnen wurden. Diese Bewertungen werden zu allen drei Zeitpunkten der Blutprobenbewertung durchgeführt und mit dem gemessenen TCA-Zyklusfluss in ihren jeweiligen Gewebebetten korreliert.
• Zirkulierende Exosomen werden auch aus den arteriovenösen Proben der Splanchnikus- und Skelettmuskelgewebebetten gewonnen, um ihr Intra-Exosomen-Proteom und -Metabolom und ihre Beziehung zum TCA-Zyklusfluss in ihren jeweiligen Gewebebetten zu bestimmen. Der Einbau von D5-Phenylalanin hilft, die Proteinbildung in den Exosomen zu verfolgen.
• Schließlich werden auch Veränderungen im Metabolom und Proteom des gesamten Körpers durchgeführt, die über die arteriovenösen Proben bestimmt werden, die aus den Splanchnikus- und Skelettmuskelgewebebetten gewonnen wurden, und mit dem TCA-Zyklusfluss in ihren jeweiligen Gewebebetten korreliert werden.