In vivo оценка клеточного метаболизма у людей

Трикарбоновые (TCA) или цикл Кребса являются «центральным узлом клеточного метаболизма», происходящим в митохондриях. Это серия последовательных химических реакций, которые генерируют клеточную энергию в форме АТФ. Кроме того, цикл обеспечивает промежуточные метаболиты, которые используются в биосинтезе аминокислот и жирных кислот, а также восстановители, такие как никотинамидадениндинуклеотид (NADH) и флавинадениндинуклеотид (FADH2), которые используются в многочисленных биохимических реакциях. Дисфункция цикла трициклических рецепторов связана с нейродегенеративными и сердечно-сосудистыми заболеваниями, метаболическими синдромами, онкогенезом и старением. Следовательно, возможность измерить активность или поток цикла ТСА как in vitro, так и in vivo имеет большое клиническое значение. Почти все исследования основаны на подходах in vitro, за исключением исследований, основанных на NMRS, которые включают несколько непроверенных предположений.

Различные исследования мечения стабильными изотопами использовались для оценки потока цикла ТСА путем измерения одного или нескольких меченых промежуточных метаболитов в цикле. К сожалению, эти меченые интермедиаты часто присутствуют только в частичных сегментах цикла из-за обмена, анаплероза (вход в цикл), катаплероза (выход из цикла) или неполного цикла. Хотя эти предыдущие исследования изотопного мечения потока цикла ТСА были качественно информативными, многие из них были неточными количественно из-за неожиданных разбавлений промежуточных продуктов цикла ТСА, возникающих из-за немеченых предшественников.

Это экспериментальное исследование по созданию новой методологии с использованием анализа потока масс-изотопомеров после инфузий 2-13C-ацетата, 2-15N-глутамина и D5-фенилаланина для измерения потока цикла TCA in vivo в тканях человека. Это исследование одновременно определит достоверность измерения потока цикла ТСА в ткани косвенно через динамические различия в обогащении мечеными промежуточными продуктами цикла ТСА между артериальным и венозным кровоснабжением этого конкретного ложа ткани (т.е. артериовенозная модель или методика атриовентрикулярного баланса). Мы предлагаем измерять скорость различных метаболических реакций в цикле ТСА, отслеживая позиционно-специфический перенос 13C и 15N между промежуточными метаболитами, чтобы охарактеризовать скорости окислительного, анаплеротического, катаплеротического и обменного процессов в цикле ТСА. Использование 2-15N-глутамина, в частности, позволит нам определить скорость поступления глутамина в цикл посредством его превращения в глутамат, что обеспечит более точную количественную оценку потока ТСА.

Эта методология будет проверена в условиях контролируемых физиологических нарушений у участников исследования, таких как низкие уровни эндогенного инсулина отдельно или в сочетании с высокими уровнями глюкагона.

Наконец, корреляционные исследования, оценивающие митохондриальную активность в ткани скелетных мышц, потребление кислорода в слоях скелетной и внутренностной тканей, роль циркулирующих экзосом, происходящих из артериовенозного кровообращения в слоях скелетной и внутренностной тканей, и изменения в метаболоме всего тела. также будут выполнены:

• Во-первых, митохондриальное дыхание будет измеряться с помощью респирометрии высокого разрешения (оксиграф, Oroboros Instruments, Инсбрук, Австрия) с использованием пошагового протокола для оценки различных компонентов системы транспорта электронов. Содержание белка в митохондриальной суспензии будет измеряться с помощью колориметрического анализа (Pierce 660-nm Protein Assay). Скорость потока кислорода будет выражена в расчете на сырую массу ткани и на миллиграмм митохондриального белка.
• Во-вторых, выбросы активных форм кислорода (АФК) также будут оцениваться на всех образцах ткани скелетных мышц. Вкратце, спектрофлуориметр Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) с контролем температуры и непрерывным перемешиванием будет использоваться для мониторинга окисления Amplex Red (Invitrogen) в свежевыделенных суспензиях митохондрий, полученных из биоптатов скелетных мышц. Окисление Amplex Red будет измеряться в присутствии глутамата (10 ммоль/л), малата (2 ммоль/л) и сукцината (10 ммоль/л). Флуоресцентный сигнал будет скорректирован с учетом фонового автоокисления и откалиброван по стандартной кривой. Скорость производства H2O2 будет выражена относительно митохондриального белка.
• В-третьих, одновременные оценки потребления кислорода и продукции углекислого газа будут определяться путем измерения газов крови в артериовенозных образцах, полученных из ложа ткани внутренних органов и скелетных мышц. Эти оценки будут выполняться во всех трех временных точках оценок образцов крови и коррелировать с измеренным циклическим потоком TCA в соответствующих тканевых слоях.
• Циркулирующие экзосомы также будут получены из артериовенозных образцов слоев ткани внутренних органов и скелетных мышц, чтобы определить его внутриэкзосомный протеом и метаболом и его связь с потоком цикла TCA в соответствующих тканевых слоях. Включение D5-фенилаланина поможет проследить образование белка в экзосомах.
• Наконец, изменения в метаболоме и протеоме всего тела, определенные с помощью артериовенозных образцов, полученных из слоев ткани внутренних органов и скелетных мышц, также будут выполняться и коррелировать с потоком цикла TCA в соответствующих слоях тканей.