In vivo vurdering av cellulær metabolisme hos mennesker

Trikarboksylsyklusen (TCA) eller Krebs-syklusen er det "sentrale navet i cellulær metabolisme" som finner sted i mitokondriene. Det er en serie av sekvensielle kjemiske reaksjoner som genererer cellulær energi i form av ATP. I tillegg gir syklusen mellommetabolitter som brukes i biosyntesen av aminosyrer og fettsyrer, samt reduksjonsmidler som nikotinamidadenindinukleotid (NADH) og flavinadenindinukleotid (FADH2) som brukes i en rekke biokjemiske reaksjoner. Dysfunksjonen til TCA-syklusen er anerkjent for sin assosiasjon i nevrodegenerative og kardiovaskulære sykdommer, metabolske syndromer, tumorgenese og aldring. Derfor har det betydelig klinisk betydning å kunne måle aktiviteten eller fluksen til TCA-syklusen enten in vitro eller in vivo. Nesten alle studier er basert på in vitro-tilnærminger bortsett fra NMRS-baserte studier som involverer flere ikke-validerte antakelser.

Ulike stabile isotopmerkingsstudier har blitt brukt for å estimere TCA-syklusfluksen ved å måle en eller flere merkede mellommetabolitter i syklusen. Dessverre er disse merkede mellomproduktene ofte til stede gjennom bare delvise segmenter av syklusen på grunn av utveksling, anaplerose (inntreden i syklusen), kataplerose (eksport ut av syklusen) eller ufullstendig sykling. Selv om disse tidligere isotopmerkingsstudiene av TCA-syklusfluksen var kvalitativt informative, var mange kvantitativt unøyaktige på grunn av uventede fortynninger av TCA-syklus-mellomproduktene som oppsto fra umerkede forløpere.

Dette er en pilotstudie for å etablere en ny metodikk ved bruk av masseisotopomer-fluksanalyse etter infusjoner av 2-13C-acetat, 2-15N-glutamin og D5-fenylalanin for å måle in vivo TCA-syklusfluksen i vev hos mennesker. Denne studien vil samtidig bestemme gyldigheten av å måle TCA-syklusfluksen i vev indirekte gjennom dynamiske forskjeller i berikelse av merkede TCA-syklus-mellomprodukter mellom arterielle og venøse blodforsyninger i den aktuelle vevssengen (dvs. arteriovenøs modell eller A-V balanseteknikk). Vi foreslår å måle hastighetene til de forskjellige metabolske reaksjonene i TCA-syklusen ved å spore den posisjonsspesifikke 13C- og 15N-overføringen mellom de mellomliggende metabolittene for å karakterisere de oksidative, anaplerotiske, kataplerotiske og utvekslingskursene over TCA-syklusen. Bruken av 2-15N-glutamin vil spesifikt tillate oss å bestemme hastigheten for glutamin som kommer inn i syklusen via konverteringen til glutamat, og gir dermed en mer nøyaktig kvantifisering av TCA-fluksen.

Denne metodikken vil bli validert i setting av kontrollerte fysiologiske forstyrrelser hos menneskelige studiedeltakere, slik som lave endogene insulinnivåer alene eller i kombinasjon med høye glukagonnivåer.

Til slutt, korrelative studier som evaluerer mitokondriell aktivitet i skjelettmuskelvevet, oksygenforbruket i skjelett- og splanchnic vevsengene, rollen til sirkulerende eksosomer avledet fra den arteriovenøse sirkulasjonen i skjelett- og splanchnic vevsengene og endringene i hele kroppens metabolom. vil også bli utført:

• Først vil mitokondriell respirasjon bli målt ved høyoppløsningsrespirometri (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Østerrike) ved hjelp av en trinnvis protokoll for å evaluere ulike komponenter i elektrontransportsystemet. Proteininnholdet i mitokondriesuspensjonen vil bli målt ved hjelp av en kolorimetrisk analyse (Pierce 660-nm Protein Assay). Oksygenstrømningshastigheter vil uttrykkes per vev-våtvekt og per milligram mitokondrielt protein.
• For det andre vil utslipp av reaktive oksygenarter (ROS) også bli evaluert på alle skjelettmuskelvevsprøver. Kort fortalt vil et Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) spektrofluorometer med temperaturkontroll og kontinuerlig omrøring bli brukt til å overvåke Amplex Red (Invitrogen) oksidasjon i fersk isolerte mitokondriesuspensjoner hentet fra skjelettmuskelbiopsiene. Amplex Red-oksidasjon vil bli målt i nærvær av glutamat (10 mmol/L), malat (2 mmol/L) og succinat (10 mmol/L). Det fluorescerende signalet vil bli korrigert for bakgrunnsautooksidasjon og kalibrert til en standardkurve. H2O2-produksjonshastighetene vil bli uttrykt i forhold til mitokondrielt protein.
• For det tredje vil samtidige vurderinger av oksygenforbruket og karbondioksidproduksjonen bli bestemt gjennom blodgassmålinger fra arteriovenøse prøvene hentet fra splanchnic og skjelettmuskelvev. Disse vurderingene vil bli utført på alle tre tidspunktene for blodprøvevurderinger og korrelert med den målte TCA-syklusfluksen i deres respektive vevsenger.
• Sirkulerende eksosomer vil også bli avledet fra de arteriovenøse prøvene av splanchnic og skjelettmuskelvevssenger for å bestemme dets intra-eksosomproteom og metabolom og dets forhold til TCA-syklusfluksen i deres respektive vevsenger. Inkorporering av D5-fenylalanin vil bidra til å spore proteindannelsen i eksosomer.
• Til slutt vil endringer i hele kroppens metabolom og proteom bestemt via de arteriovenøse prøvene hentet fra splanchnic og skjelettmuskelvev også bli utført og korrelert med TCA-syklusfluksen i deres respektive vevsenger.