In vivo hodnocení buněčného metabolismu u lidí

Trikarboxylový (TCA) nebo Krebsův cyklus je „centrálním centrem buněčného metabolismu“, který se odehrává v mitochondriích. Jde o sérii sekvenčních chemických reakcí, které generují buněčnou energii ve formě ATP. Kromě toho cyklus poskytuje intermediární metabolity, které se využívají při biosyntéze aminokyselin a mastných kyselin, stejně jako redukční činidla, jako je nikotinamid adenindinukleotid (NADH) a flavinadenindinukleotid (FADH2), které se používají v mnoha biochemických reakcích. Dysfunkce cyklu TCA je uznávána pro svou souvislost s neurodegenerativními a kardiovaskulárními onemocněními, metabolickými syndromy, tumorigenezí a stárnutím. Schopnost měřit aktivitu nebo tok cyklu TCA buď in vitro nebo in vivo má tedy významný klinický význam. Téměř všechny studie jsou založeny na přístupech in vitro s výjimkou studií založených na NMRS, které zahrnují více nevalidovaných předpokladů.

K odhadu toku cyklu TCA měřením jednoho nebo více značených meziproduktových metabolitů v cyklu byly použity různé studie značení stabilních izotopů. Bohužel tyto označené meziprodukty jsou často přítomny pouze v dílčích segmentech cyklu v důsledku výměny, anaplerózy (vstup do cyklu), kataplerózy (export z cyklu) nebo neúplného cyklování. Ačkoli tyto předchozí studie izotopového značení toku cyklu TCA byly kvalitativně informativní, mnohé z nich byly kvantitativně nepřesné kvůli neočekávaným ředěním meziproduktů cyklu TCA pocházejících z neznačených prekurzorů.

Toto je pilotní studie k vytvoření nové metodologie využívající analýzu toku hmotnostních izotopomerů po infuzích 2-13C-acetátu, 2-15N-glutaminu a D5-fenylalaninu k měření toku cyklu TCA in vivo v tkáních lidských bytostí. Tato studie současně určí validitu měření toku cyklu TCA ve tkáni nepřímo prostřednictvím dynamických rozdílů v obohacení značených meziproduktů cyklu TCA mezi arteriálními a venózními zásobami krve daného tkáňového lůžka (tj. arteriovenózní model nebo technika A-V rovnováhy). Navrhujeme měřit rychlosti různých metabolických reakcí v rámci cyklu TCA sledováním polohově specifického přenosu 13C a 15N mezi intermediárními metabolity, abychom charakterizovali oxidační, anaplerotické, kataplerotické a výměnné rychlosti v rámci cyklu TCA. Použití 2-15N-Glutaminu nám konkrétně umožní určit rychlost vstupu glutaminu do cyklu prostřednictvím jeho přeměny na glutamát, a tím poskytnout přesnější kvantifikaci toku TCA.

Tato metodika bude ověřena v podmínkách kontrolovaných fyziologických poruch u účastníků studie na lidech, jako jsou nízké hladiny endogenního inzulínu samostatně nebo v kombinaci s vysokými hladinami glukagonu.

Konečně, korelační studie hodnotící mitochondriální aktivitu ve tkáni kosterního svalstva, spotřebu kyslíku v lůžkách kosterní a splanchnické tkáně, roli cirkulujících exozomů odvozených z arteriovenózní cirkulace lůžek kosterní a splanchnické tkáně a změny v celém tělesném metabolomu se bude také provádět:

• Nejprve bude mitochondriální respirace měřena respirometrií s vysokým rozlišením (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Rakousko) za použití postupného protokolu k vyhodnocení různých složek systému přenosu elektronů. Obsah proteinu v mitochondriální suspenzi bude měřen pomocí kolorimetrického testu (Pierce 660-nm Protein Assay). Rychlosti toku kyslíku budou vyjádřeny na hmotnost vlhké tkáně a na miligram mitochondriálního proteinu.
• Za druhé, emise reaktivních forem kyslíku (ROS) budou také hodnoceny na všech vzorcích tkáně kosterního svalstva. Stručně řečeno, spektrofluorometr Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) s regulací teploty a nepřetržitým mícháním bude použit k monitorování oxidace Amplex Red (Invitrogen) v čerstvě izolovaných mitochondriálních suspenzích získaných z biopsií kosterního svalstva. Oxidace Amplex Red bude měřena v přítomnosti glutamátu (10 mmol/l), malátu (2 mmol/l) a sukcinátu (10 mmol/l). Fluorescenční signál bude korigován na autooxidaci pozadí a kalibrován na standardní křivku. Rychlosti produkce H2O2 budou vyjádřeny relativně k mitochondriálnímu proteinu.
• Za třetí, simultánní hodnocení spotřeby kyslíku a produkce oxidu uhličitého bude provedeno měřením krevních plynů z arteriovenózních vzorků získaných z lůžek splanchnické a kosterní svalové tkáně. Tato hodnocení budou provedena ve všech třech časových bodech hodnocení krevních vzorků a budou korelována s naměřeným tokem cyklu TCA v jejich příslušných tkáňových lůžkách.
• Cirkulující exozomy budou také odvozeny z arteriovenózních vzorků tkáňových lůžek splanchnického a kosterního svalstva, aby se určil jejich intraexozomový proteom a metabolom a jeho vztah s tokem cyklu TCA v příslušných tkáňových lůžkách. Začlenění D5-fenylalaninu pomůže vysledovat tvorbu proteinu v exozomech.
• Nakonec budou také provedeny změny v celém tělesném metabolomu a proteomu stanovené prostřednictvím arteriovenózních vzorků získaných z lůžek splanchnické a kosterní svalové tkáně a budou korelovány s tokem cyklu TCA v příslušných tkáňových lůžkách.