Avaliação In Vivo do Metabolismo Celular em Humanos

O tricarboxílico (TCA) ou ciclo de Krebs é o "centro central do metabolismo celular" que ocorre dentro da mitocôndria. É uma série de reações químicas sequenciais que geram energia celular na forma de ATP. Além disso, o ciclo fornece metabólitos intermediários que são utilizados na biossíntese de aminoácidos e ácidos graxos, bem como agentes redutores como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e flavina adenina dinucleotídeo (FADH2) que são usados ​​em inúmeras reações bioquímicas. A disfunção do ciclo do TCA é reconhecida por sua associação em doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, síndromes metabólicas, tumorigênese e envelhecimento. Portanto, ser capaz de medir a atividade ou fluxo do ciclo do TCA in vitro ou in vivo tem significado clínico significativo. Quase todos os estudos são baseados em abordagens in vitro, exceto estudos baseados em NMRS que envolvem várias suposições não validadas.

Vários estudos de marcação de isótopos estáveis ​​foram usados ​​para estimar o fluxo do ciclo do TCA medindo um ou mais metabólitos intermediários marcados dentro do ciclo. Infelizmente, esses intermediários marcados estão frequentemente presentes apenas em segmentos parciais do ciclo devido à troca, anaplerose (entrada no ciclo), cataplerose (exclusão do ciclo) ou ciclagem incompleta. Embora esses estudos anteriores de marcação de isótopos do fluxo do ciclo do TCA fossem qualitativamente informativos, muitos eram quantitativamente imprecisos devido a diluições inesperadas dos intermediários do ciclo do TCA decorrentes de precursores não marcados.

Este é um estudo piloto para estabelecer uma nova metodologia usando análise de fluxo de isotopômeros de massa após infusões de 2-13C-Acetate, 2-15N-Glutamina e D5-fenilalanina para medir o fluxo do ciclo do TCA in vivo em tecidos de seres humanos. Este estudo determinará simultaneamente a validade de medir o fluxo do ciclo do TCA no tecido indiretamente por meio de diferenças dinâmicas no enriquecimento dos intermediários do ciclo do TCA marcados entre os suprimentos de sangue arterial e venoso desse leito de tecido específico (ou seja, modelo arteriovenoso ou técnica de equilíbrio A-V). Propomos medir as taxas das diferentes reações metabólicas dentro do ciclo do TCA traçando a transferência de posição específica de 13C e 15N entre os metabólitos intermediários, a fim de caracterizar as taxas oxidativas, anapleróticas, catapleróticas e de troca ao longo do ciclo do TCA. A utilização da 2-15N-Glutamina permitirá especificamente determinar a taxa de entrada da glutamina no ciclo através da sua conversão em glutamato, proporcionando assim uma quantificação mais precisa do fluxo de TCA.

Esta metodologia será validada no cenário de perturbações fisiológicas controladas em participantes do estudo humano, como baixos níveis de insulina endógena isoladamente ou em combinação com altos níveis de glucagon.

Por fim, estudos correlativos avaliando a atividade mitocondrial no tecido muscular esquelético, o consumo de oxigênio nos leitos de tecido esquelético e esplâncnico, o papel dos exossomos circulantes derivados da circulação arteriovenosa dos leitos de tecido esquelético e esplâncnico e as alterações no metaboloma de todo o corpo também será realizado:

• Primeiro, a respiração mitocondrial será medida por respirometria de alta resolução (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria) usando um protocolo passo a passo para avaliar vários componentes do sistema de transporte de elétrons. O teor de proteína da suspensão mitocondrial será medido usando um ensaio colorimétrico (Pierce 660-nm Protein Assay). As taxas de fluxo de oxigênio serão expressas por peso úmido de tecido e por miligrama de proteína mitocondrial.
• Em segundo lugar, as emissões de espécies reativas de oxigênio (ROS) também serão avaliadas em todas as amostras de tecido muscular esquelético. Resumidamente, um espectrofluorômetro Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) com controle de temperatura e agitação contínua será usado para monitorar a oxidação de Amplex Red (Invitrogen) em suspensões mitocondriais isoladas recentemente obtidas de biópsias de músculo esquelético. A oxidação do Amplex Red será medida na presença de glutamato (10 mmol/L), malato (2 mmol/L) e succinato (10 mmol/L). O sinal fluorescente será corrigido para auto-oxidação de fundo e calibrado para uma curva padrão. As taxas de produção de H2O2 serão expressas em relação à proteína mitocondrial.
• Em terceiro lugar, avaliações simultâneas do consumo de oxigênio e produção de dióxido de carbono serão determinadas por meio de medições de gases sanguíneos das amostras arteriovenosas obtidas dos leitos de tecido muscular esplâncnico e esquelético. Essas avaliações serão realizadas em todos os três momentos das avaliações de amostras de sangue e correlacionadas com o fluxo do ciclo de TCA medido em seus respectivos leitos de tecido.
• Exossomos circulantes também serão derivados de amostras arteriovenosas dos leitos de tecido muscular esplâncnico e esquelético para determinar seu proteoma e metaboloma intra-exossoma e sua relação com o fluxo do ciclo do TCA em seus respectivos leitos teciduais. A incorporação de D5-fenilalanina ajudará a rastrear a formação da proteína nos exossomos.
• Por fim, também serão realizadas alterações no metaboloma e proteoma de todo o corpo determinadas através das amostras arteriovenosas obtidas dos leitos de tecido esplâncnico e músculo esquelético e correlacionadas com o fluxo do ciclo do TCA em seus respectivos leitos teciduais.