Valutazione in vivo del metabolismo cellulare negli esseri umani

Il ciclo tricarbossilico (TCA) o di Krebs è il "fulcro centrale del metabolismo cellulare" che si svolge all'interno dei mitocondri. È una serie di reazioni chimiche sequenziali che generano energia cellulare sotto forma di ATP. Inoltre, il ciclo fornisce metaboliti intermedi che vengono utilizzati nella biosintesi di aminoacidi e acidi grassi, nonché agenti riducenti come nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e flavina adenina dinucleotide (FADH2) che vengono utilizzati in numerose reazioni biochimiche. La disfunzione del ciclo TCA è riconosciuta per la sua associazione a malattie neurodegenerative e cardiovascolari, sindromi metaboliche, tumorigenesi e invecchiamento. Pertanto, essere in grado di misurare l'attività o il flusso del ciclo TCA in vitro o in vivo ha un significato clinico significativo. Quasi tutti gli studi si basano su approcci in vitro, ad eccezione degli studi basati su NMRS che implicano ipotesi multiple non convalidate.

Vari studi di etichettatura degli isotopi stabili sono stati utilizzati per stimare il flusso del ciclo TCA misurando uno o più metaboliti intermedi etichettati all'interno del ciclo. Sfortunatamente, questi intermedi marcati sono spesso presenti solo attraverso segmenti parziali del ciclo a causa di scambio, anaplerosi (ingresso nel ciclo), cataplerosi (esportazione fuori dal ciclo) o ciclo incompleto. Sebbene questi precedenti studi di etichettatura degli isotopi del flusso del ciclo TCA fossero qualitativamente informativi, molti erano quantitativamente imprecisi a causa di diluizioni impreviste degli intermedi del ciclo TCA derivanti da precursori non etichettati.

Questo è uno studio pilota per stabilire una nuova metodologia utilizzando l'analisi del flusso isotopomerico di massa dopo infusioni di 2-13C-acetato, 2-15N-glutammina e D5-fenilalanina per misurare il flusso del ciclo TCA in vivo nei tessuti degli esseri umani. Questo studio determinerà contemporaneamente la validità della misurazione del flusso del ciclo TCA nel tessuto indirettamente attraverso le differenze dinamiche nell'arricchimento degli intermedi del ciclo TCA marcati tra i rifornimenti di sangue arterioso e venoso di quel particolare letto di tessuto (ad es. modello arterovenoso o tecnica dell'equilibrio A-V). Proponiamo di misurare i tassi delle diverse reazioni metaboliche all'interno del ciclo TCA tracciando il trasferimento posizione-specifico di 13C e 15N tra i metaboliti intermedi al fine di caratterizzare i tassi ossidativi, anaplerotici, cataplerotici e di scambio attraverso il ciclo TCA. L'uso di 2-15N-glutammina ci consentirà specificamente di determinare il tasso di ingresso della glutammina nel ciclo attraverso la sua conversione in glutammato, fornendo così una quantificazione più accurata del flusso di TCA.

Questa metodologia sarà convalidata nel contesto di perturbazioni fisiologiche controllate nei partecipanti allo studio umano come bassi livelli di insulina endogena da soli o in combinazione con alti livelli di glucagone.

Infine, studi correlati che valutano l'attività mitocondriale nel tessuto muscolare scheletrico, il consumo di ossigeno nei letti del tessuto scheletrico e splancnico, il ruolo degli esosomi circolanti derivati ​​dalla circolazione arterovenosa dei letti del tessuto scheletrico e splancnico e i cambiamenti nel metaboloma dell'intero corpo verranno eseguiti anche:

• In primo luogo, la respirazione mitocondriale sarà misurata mediante respirometria ad alta risoluzione (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) utilizzando un protocollo graduale per valutare vari componenti del sistema di trasporto degli elettroni. Il contenuto proteico della sospensione mitocondriale sarà misurato mediante un test colorimetrico (Pierce 660-nm Protein Assay). I flussi di ossigeno saranno espressi per peso tessuto umido e per milligrammo di proteina mitocondriale.
• In secondo luogo, verranno valutate anche le emissioni di specie reattive dell'ossigeno (ROS) su tutti i campioni di tessuto muscolare scheletrico. In breve, uno spettrofluorimetro Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) con controllo della temperatura e agitazione continua verrà utilizzato per monitorare l'ossidazione dell'Amplex Red (Invitrogen) in sospensioni mitocondriali appena isolate ottenute dalle biopsie del muscolo scheletrico. L'ossidazione dell'Amplex Red sarà misurata in presenza di glutammato (10 mmol/L), malato (2 mmol/L) e succinato (10 mmol/L). Il segnale fluorescente sarà corretto per l'autoossidazione di fondo e calibrato su una curva standard. I tassi di produzione di H2O2 saranno espressi rispetto alla proteina mitocondriale.
• In terzo luogo, le valutazioni simultanee del consumo di ossigeno e della produzione di anidride carbonica saranno determinate attraverso misurazioni dei gas ematici dai campioni arterovenosi ottenuti dai letti di tessuto muscolare splancnico e scheletrico. Queste valutazioni saranno eseguite in tutti e tre i punti temporali delle valutazioni del campione di sangue e correlate con il flusso del ciclo TCA misurato nei rispettivi letti di tessuto.
• Gli esosomi circolanti saranno anche derivati ​​dai campioni arterovenosi dei letti di tessuto muscolare splancnico e scheletrico per determinare il suo proteoma e metaboloma intra-esosomiale e la sua relazione con il flusso del ciclo TCA nei rispettivi letti di tessuto. L'incorporazione di D5-fenilalanina aiuterà a tracciare la formazione proteica negli esosomi.
• Infine, i cambiamenti nel metaboloma e nel proteoma di tutto il corpo determinati tramite i campioni arterovenosi ottenuti dai letti di tessuto muscolare splancnico e scheletrico saranno anche eseguiti e correlati con il flusso del ciclo TCA nei rispettivi letti di tessuto.