In vivo-bedömning av cellulär metabolism hos människor

Trikarboxylcykeln (TCA) eller Krebs-cykeln är den "centrala navet i cellulär metabolism" som äger rum i mitokondrierna. Det är en serie sekventiella kemiska reaktioner som genererar cellulär energi i form av ATP. Dessutom tillhandahåller cykeln intermediära metaboliter som används i biosyntesen av aminosyror och fettsyror samt reduktionsmedel som nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och flavinadenindinukleotid (FADH2) som används i många biokemiska reaktioner. Dysfunktionen i TCA-cykeln är erkänd för dess associering i neurodegenerativa och kardiovaskulära sjukdomar, metabola syndrom, tumörbildning och åldrande. Att kunna mäta aktiviteten eller flödet av TCA-cykeln antingen in vitro eller in vivo har därför signifikant klinisk betydelse. Nästan alla studier är baserade på in vitro-metoder förutom NMRS-baserade studier som involverar flera icke-validerade antaganden.

Olika stabila isotopmärkningsstudier har använts för att uppskatta TCA-cykelflödet genom att mäta en eller flera märkta intermediära metaboliter inom cykeln. Tyvärr är dessa märkta mellanprodukter ofta närvarande genom endast partiella segment av cykeln på grund av utbyte, anapleros (inträde i cykeln), katapleros (export ut ur cykeln) eller ofullständig cykling. Även om dessa tidigare isotopmärkningsstudier av TCA-cykelflödet var kvalitativt informativa, var många kvantitativt felaktiga på grund av oväntade utspädningar av TCA-cykelintermediärerna som härrör från omärkta prekursorer.

Detta är en pilotstudie för att etablera en ny metodik som använder massisotopomerflödesanalys efter infusioner av 2-13C-acetat, 2-15N-glutamin och D5-fenylalanin för att mäta in vivo TCA-cykelflödet i vävnader hos människor. Denna studie kommer samtidigt att bestämma giltigheten av att mäta TCA-cykelflödet i vävnad indirekt genom dynamiska skillnader i anrikning av märkta TCA-cykelintermediärer mellan arteriell och venös blodtillförsel i den specifika vävnadsbädden (dvs. arteriovenös modell eller A-V balansteknik). Vi föreslår att mäta hastigheterna för de olika metaboliska reaktionerna inom TCA-cykeln genom att spåra den positionsspecifika 13C- och 15N-överföringen mellan de intermediära metaboliterna för att karakterisera de oxidativa, anaplerotiska, kataplerotiska och växelkurserna över TCA-cykeln. Användningen av 2-15N-glutamin kommer specifikt att tillåta oss att bestämma hastigheten för glutamin som kommer in i cykeln via dess omvandling till glutamat, vilket ger en mer exakt kvantifiering av TCA-flödet.

Denna metod kommer att valideras i inställningen av kontrollerade fysiologiska störningar hos mänskliga studiedeltagare, såsom låga endogena insulinnivåer enbart eller i kombination med höga glukagonnivåer.

Slutligen, korrelativa studier som utvärderar mitokondriell aktivitet i skelettmuskelvävnaden, syreförbrukningen i skelett- och splanchnic vävnadsbäddarna, rollen av cirkulerande exosomer härledda från den arteriovenösa cirkulationen i skelett- och splanchnic vävnadsbäddarna och förändringarna i hela kroppens metabolom kommer också att utföras:

• Först kommer mitokondriell andning att mätas med högupplöst respirometri (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Österrike) med hjälp av ett stegvis protokoll för att utvärdera olika komponenter i elektrontransportsystemet. Proteininnehållet i den mitokondriella suspensionen kommer att mätas med en kolorimetrisk analys (Pierce 660-nm Protein Assay). Syreflödeshastigheter kommer att uttryckas per vävnadsvåt vikt och per milligram mitokondrieprotein.
• För det andra kommer utsläpp av reaktiva syrearter (ROS) också att utvärderas på alla skelettmuskelvävnadsprover. Kortfattat kommer en Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) spektrofluorometer med temperaturkontroll och kontinuerlig omrörning att användas för att övervaka Amplex Red (Invitrogen) oxidation i nyligen isolerade mitokondriesuspensioner erhållna från skelettmuskelbiopsierna. Amplex Red-oxidation kommer att mätas i närvaro av glutamat (10 mmol/L), malat (2 mmol/L) och succinat (10 mmol/L). Den fluorescerande signalen kommer att korrigeras för bakgrundsautooxidation och kalibreras till en standardkurva. H2O2-produktionshastigheterna kommer att uttryckas i förhållande till mitokondrieprotein.
• För det tredje kommer samtidiga bedömningar av syreförbrukningen och koldioxidproduktionen att bestämmas genom blodgasmätningar från arteriovenösa prover som erhålls från splanchnic och skelettmuskelvävnadsbäddar. Dessa bedömningar kommer att utföras vid alla tre tidpunkter för blodprovsbedömningar och korreleras med det uppmätta TCA-cykelflödet i deras respektive vävnadsbäddar.
• Cirkulerande exosomer kommer också att härledas från arteriovenösa prover från splanchnic och skelettmuskelvävnadsbäddar för att bestämma dess intra-exosomer proteom och metabolom och dess förhållande till TCA-cykelflödet i deras respektive vävnadsbäddar. Inkorporering av D5-fenylalanin hjälper till att spåra proteinbildningen i exosomer.
• Slutligen kommer förändringar i hela kroppens metabolom och proteom bestämda via de arteriovenösa proverna som erhålls från splanchnic och skelettmuskelvävnadsbäddar också att utföras och korreleras med TCA-cykelflödet i deras respektive vävnadsbäddar.