人体细胞代谢的体内评估

三羧酸 (TCA) 或克雷布斯循环是在线粒体内发生的“细胞代谢的中心枢纽”。 它是一系列连续的化学反应，以 ATP 的形式产生细胞能量。 此外，该循环提供了用于氨基酸和脂肪酸生物合成的中间代谢物，以及用于许多生化反应的还原剂，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 和黄素腺嘌呤二核苷酸 (FADH2)。 TCA 循环的功能障碍因其与神经退行性和心血管疾病、代谢综合征、肿瘤发生和衰老的关联而得到认可。 因此，能够在体外或体内测量 TCA 循环的活性或通量具有重要的临床意义。 几乎所有研究都基于体外方法，但基于 NMRS 的研究除外，这些研究涉及多个未经验证的假设。

各种稳定同位素标记研究已被用于通过测量循环内的一种或多种标记的中间代谢物来估计 TCA 循环通量。 不幸的是，这些标记的中间体通常由于交换、回补（进入循环）、僵化（输出循环）或不完全循环而仅存在于循环的部分片段中。 尽管这些先前对 TCA 循环通量的同位素标记研究提供了定性信息，但由于未标记前体引起的 TCA 循环中间体意外稀释，许多在定量上不准确。

这是一项试点研究，目的是在输注 2-13C-乙酸盐、2-15N-谷氨酰胺和 D5-苯丙氨酸后使用质量同位素流量分析建立一种新方法，以测量人体组织中的体内 TCA 循环流量。 本研究将同时确定通过特定组织床的动脉和静脉血液供应之间标记的 TCA 循环中间体富集的动态差异间接测量组织中 TCA 循环通量的有效性（即 动静脉模型或 A-V 平衡技术）。 我们建议通过追踪中间代谢物之间的位置特异性 13C 和 15N 转移来测量 TCA 循环中不同代谢反应的速率，以表征 TCA 循环中的氧化、回补、催化和交换率。 2-15N-谷氨酰胺的使用将特别允许我们确定谷氨酰胺通过转化为谷氨酸进入循环的速率，从而提供更准确的 TCA 通量量化。

这种方法将在人类研究参与者的受控生理扰动的环境中得到验证，例如单独的低内源性胰岛素水平或与高胰高血糖素水平的组合。

最后，相关研究评估了骨骼肌组织中的线粒体活性、骨骼和内脏组织床的耗氧量、来自骨骼和内脏组织床的动静脉循环的循环外泌体的作用以及全身代谢组的变化还将执行：

• 首先，线粒体呼吸将通过高分辨率呼​​吸测量法（Oxygraph，Oroboros Instruments，Innsbruck，Austria）使用逐步方案来测量，以评估电子传输系统的各种组件。 将使用比色测定法（Pierce 660-nm 蛋白质测定法）测量线粒体悬浮液的蛋白质含量。 氧通量率将表示为每组织湿重和每毫克线粒体蛋白。
• 其次，还将评估所有骨骼肌组织样本的活性氧 (ROS) 排放量。 简而言之，将使用具有温度控制和连续搅拌功能的 Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) 荧光分光光度计来监测从骨骼肌活检中获得的新鲜分离的线粒体悬浮液中的 Amplex Red (Invitrogen) 氧化。 将在谷氨酸 (10 mmol/L)、苹果酸 (2 mmol/L) 和琥珀酸 (10 mmol/L) 存在的情况下测量 Amplex Red 氧化。 荧光信号将针对背景自动氧化进行校正，并校准为标准曲线。 H2O2 生产率将相对于线粒体蛋白表示。
• 第三，将通过从内脏和骨骼肌组织床获得的动静脉样本的血气测量来确定耗氧量和二氧化碳产生的同时评估。 这些评估将在血液样本评估的所有三个时间点进行，并与它们各自组织床中测量的 TCA 循环通量相关联。
• 循环外泌体也将从内脏和骨骼肌组织床的动静脉样本中提取，以确定其外泌体内蛋白质组和代谢组及其与各自组织床中 TCA 循环通量的关系。 D5-苯丙氨酸的加入将有助于追踪外泌体中蛋白质的形成。
• 最后，还将执行通过从内脏和骨骼肌组织床获得的动静脉样本确定的全身代谢组和蛋白质组的变化，并将其与各自组织床中的 TCA 循环通量相关联。