Ihmisten soluaineenvaihdunnan in vivo -arviointi

Trikarboksyyli (TCA) tai Krebsin sykli on "solujen aineenvaihdunnan keskuskeskus", joka tapahtuu mitokondrioissa. Se on sarja peräkkäisiä kemiallisia reaktioita, jotka tuottavat soluenergiaa ATP:n muodossa. Lisäksi sykli tarjoaa välituotemetaboliitteja, joita hyödynnetään aminohappojen ja rasvahappojen biosynteesissä, sekä pelkistäviä aineita, kuten nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia (NADH) ja flaviiniadeniinidinukleotidia (FADH2), joita käytetään lukuisissa biokemiallisissa reaktioissa. TCA-syklin toimintahäiriö tunnetaan sen yhteydestä neurodegeneratiivisiin ja sydän- ja verisuonisairauksiin, metabolisiin oireyhtymiin, kasvainten muodostumiseen ja ikääntymiseen. Siten kyvyllä mitata TCA-syklin aktiivisuutta tai virtausta joko in vitro tai in vivo on merkittävä kliininen merkitys. Melkein kaikki tutkimukset perustuvat in vitro -lähestymistapoihin paitsi NMRS-pohjaisiin tutkimuksiin, joihin liittyy useita validoimattomia oletuksia.

Erilaisia ​​stabiileja isotooppileimaustutkimuksia on käytetty arvioimaan TCA-syklin virtaa mittaamalla yksi tai useampi leimattu välimetaboliitti syklin sisällä. Valitettavasti näitä leimattuja välituotteita esiintyy usein vain osissa syklistä johtuen vaihdosta, anapleroosista (saapuminen kiertoon), catapleroosista (vienti kierrosta) tai epätäydellisestä syklistä. Vaikka nämä aiemmat isotooppileimaustutkimukset TCA-syklin vuosta olivat laadullisesti informatiivisia, monet olivat kvantitatiivisesti epätarkkoja TCA-syklin välituotteiden odottamattomien laimennosten vuoksi, jotka johtuivat leimaamattomista esiasteista.

Tämä on pilottitutkimus uuden metodologian luomiseksi käyttämällä massa-isotopomeerivirtausanalyysiä 2-13C-asetaatin, 2-15N-glutamiinin ja D5-fenyylialaniinin infuusioiden jälkeen mittaamaan in vivo TCA-syklin virtaa ihmisen kudoksissa. Tämä tutkimus määrittää samanaikaisesti kudoksen TCA-syklin virtauksen mittaamisen pätevyyden epäsuorasti leimattujen TCA-syklin välituotteiden rikastumisen dynaamisten erojen kautta kyseisen kudoskerroksen valtimon ja laskimoveren välillä (ts. arteriovenoosimalli tai A-V-tasapainotekniikka). Ehdotamme TCA-syklin eri metabolisten reaktioiden nopeuksien mittaamista seuraamalla paikkaspesifistä 13C- ja 15N-siirtoa väliaineenvaihduntatuotteiden välillä, jotta voidaan karakterisoida oksidatiiviset, anapleroottiset, katapleroottiset ja vaihtokurssit TCA-syklin aikana. 2-15N-glutamiinin käyttö mahdollistaa erityisesti sen, että voimme määrittää glutamiinin sisääntulonopeuden kiertoon sen muuntumisen kautta glutamaatiksi, mikä tarjoaa tarkemman TCA-virran kvantifioinnin.

Tämä menetelmä validoidaan kontrolloiduissa fysiologisissa häiriöissä ihmistutkimuksen osallistujilla, kuten matalat endogeeniset insuliinitasot yksinään tai yhdessä korkeiden glukagonitasojen kanssa.

Lopuksi korrelatiiviset tutkimukset, joissa arvioidaan mitokondrioiden aktiivisuutta luurankolihaskudoksessa, hapenkulutusta luusto- ja splanknisessa kudoksessa, luuston ja splanknisen kudoskerroksen arteriovenoosista verenkierrosta peräisin olevien kiertävien eksosomien roolia sekä muutoksia koko kehon metabolomissa. esitetään myös:

• Ensin mitokondriohengitys mitataan korkearesoluutioisella respirometrialla (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Itävalta) käyttämällä vaiheittaista protokollaa elektroninkuljetusjärjestelmän eri komponenttien arvioimiseksi. Mitokondriosuspension proteiinipitoisuus mitataan käyttämällä kolorimetristä määritystä (Pierce 660-nm Protein Assay). Hapen virtausnopeudet ilmaistaan ​​kudoksen märkäpainoa ja mitokondrioproteiinin milligrammaa kohti.
• Toiseksi reaktiivisten happilajikkeiden (ROS) päästöt arvioidaan myös kaikista luustolihaskudosnäytteistä. Lyhyesti sanottuna Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) spektrofluorometriä, jossa on lämpötilan säätö ja jatkuva sekoitus, käytetään Amplex Redin (Invitrogen) hapettumisen seuraamiseen juuri eristetyissä mitokondriosuspensioissa, jotka on saatu luurankolihasbiopsioista. Amplex Redin hapettuminen mitataan glutamaatin (10 mmol/L), malaatin (2 mmol/L) ja sukkinaatin (10 mmol/L) läsnä ollessa. Fluoresoiva signaali korjataan taustan automaattisen hapettumisen suhteen ja kalibroidaan standardikäyrään. H2O2:n tuotantonopeudet ilmaistaan ​​suhteessa mitokondrioproteiiniin.
• Kolmanneksi hapenkulutuksen ja hiilidioksidin tuotannon samanaikaiset arvioinnit määritetään verikaasumittauksilla valtimolaskimonäytteistä, jotka on otettu splanchni- ja luustolihaskudoskerroksista. Nämä arvioinnit suoritetaan kaikissa kolmessa verinäytearvioinnin ajankohtana ja korreloivat mitatun TCA-syklin vuon kanssa vastaavissa kudoskerroksissa.
• Verenkierrossa olevat eksosomit johdetaan myös splanchnisen ja luuston lihaskudoskerroksen arteriovenoosisista näytteistä sen eksosomin sisäisen proteomin ja metabolomin määrittämiseksi ja sen suhteen TCA-syklin virtaukseen vastaavissa kudoskerroksissa. D5-fenyylialaniinin sisällyttäminen auttaa jäljittämään proteiinin muodostumista eksosomeissa.
• Lopuksi tehdään myös muutoksia koko kehon metabolomissa ja proteomissa, jotka määritetään splanchnisista ja luustolihaskudoskerroksista saatujen valtimolaskimonäytteiden kautta, ja ne korreloidaan TCA-syklin vuon kanssa vastaavissa kudoskerroksissa.