인간의 세포 대사에 대한 생체 내 평가

트리카르복실(TCA) 또는 크렙스 주기는 미토콘드리아 내에서 일어나는 "세포 대사의 중심 허브"입니다. ATP의 형태로 세포 에너지를 생성하는 일련의 순차적인 화학 반응입니다. 또한 이 순환은 수많은 생화학 반응에 사용되는 NADH(nicotinamide adenine dinucleotide) 및 FADH2(flavin adenine dinucleotide)와 같은 환원제뿐만 아니라 아미노산 및 지방산의 생합성에 사용되는 중간 대사산물을 제공합니다. TCA 주기의 기능 장애는 신경퇴행성 및 심혈관 질환, 대사 증후군, 종양 형성 및 노화와의 연관성으로 인식됩니다. 따라서 시험관 내 또는 생체 내에서 TCA 주기의 활성 또는 플럭스를 측정할 수 있다는 것은 중요한 임상적 의미를 지닙니다. 거의 모든 연구는 검증되지 않은 여러 가정을 포함하는 NMRS 기반 연구를 제외하고 시험관 내 접근 방식을 기반으로 합니다.

주기 내에서 하나 이상의 표지된 중간 대사산물을 측정하여 TCA 주기 플럭스를 추정하기 위해 다양한 안정 동위원소 표지 연구가 사용되었습니다. 불행하게도, 이러한 라벨이 붙은 중간체는 종종 교환, anaplerosis(주기 진입), cataplerosis(주기 외부로 내보내기) 또는 불완전한 순환으로 인해 주기의 일부 부분에만 존재합니다. TCA 주기 플럭스에 대한 이러한 이전의 동위원소 표지 연구는 질적으로 유익했지만, 표지되지 않은 전구체에서 발생하는 TCA 주기 중간체의 예기치 않은 희석으로 인해 많은 양이 정량적으로 부정확했습니다.

이것은 인간의 조직에서 생체 내 TCA 사이클 플럭스를 측정하기 위해 2-13C-아세테이트, 2-15N-글루타민 및 D5-페닐알라닌을 주입한 후 질량-이소토포머 플럭스 분석을 사용하여 새로운 방법론을 확립하기 위한 파일럿 연구입니다. 이 연구는 특정 조직 베드의 동맥 및 정맥 혈액 공급 사이의 표지된 TCA 주기 중간체의 동적 차이를 통해 간접적으로 조직의 TCA 주기 플럭스를 측정하는 타당성을 동시에 결정할 것입니다(즉, 동정맥 모델 또는 A-V 균형 기술). 우리는 TCA 주기에서 산화, 보충, 촉매 및 교환 비율을 특성화하기 위해 중간 대사 산물 사이의 위치 특정 13C 및 15N 전달을 추적하여 TCA 주기 내에서 다양한 대사 반응의 속도를 측정할 것을 제안합니다. 2-15N-글루타민을 사용하면 특히 글루타메이트로의 전환을 통해 사이클에 들어가는 글루타민의 비율을 결정할 수 있으므로 TCA 플럭스를 보다 정확하게 정량화할 수 있습니다.

이 방법론은 낮은 내인성 인슐린 수치 단독 또는 높은 글루카곤 수치와 함께 인간 연구 참가자의 제어된 생리학적 동요 설정에서 검증될 것입니다.

마지막으로, 골격근 조직의 미토콘드리아 활성, 골격 및 내장 조직층에서의 산소 소비량, 골격 및 내장 조직층의 동정맥 순환에서 파생된 순환 엑소좀의 역할 및 전신 대사체의 변화를 평가하는 상관 연구 또한 수행됩니다:

• 첫째, 미토콘드리아 호흡은 전자 수송 시스템의 다양한 구성 요소를 평가하기 위해 단계별 프로토콜을 사용하여 고해상도 호흡 측정법(Oxygraph, Oroboros Instruments, 오스트리아 인스브루크)으로 측정됩니다. 미토콘드리아 현탁액의 단백질 함량은 비색 분석(Pierce 660-nm 단백질 분석)을 사용하여 측정됩니다. 산소 플럭스 속도는 조직 습윤 중량 및 미토콘드리아 단백질 밀리그램당 표현됩니다.
• 둘째, 활성산소종(ROS) 방출도 모든 골격근 조직 샘플에서 평가됩니다. 간단히 말해서, 온도 제어 및 연속 교반 기능이 있는 Fluorolog 3(Horiba Jobin Yvon) 분광형광계를 사용하여 골격근 생검에서 얻은 새로 분리된 미토콘드리아 현탁액에서 Amplex Red(Invitrogen) 산화를 모니터링합니다. Amplex Red 산화는 글루타메이트(10mmol/L), 말레이트(2mmol/L) 및 석시네이트(10mmol/L)의 존재 하에 측정됩니다. 형광 신호는 배경 자동 산화에 대해 보정되고 표준 곡선으로 보정됩니다. H2O2 생산 속도는 미토콘드리아 단백질에 상대적으로 표시됩니다.
• 셋째, 내장 및 골격근 조직층에서 얻은 동정맥 샘플의 혈액 가스 측정을 통해 산소 소비량과 이산화탄소 생성량을 동시에 평가합니다. 이러한 평가는 혈액 샘플 평가의 세 시점 모두에서 수행되며 각각의 조직 베드에서 측정된 TCA 주기 플럭스와 상관됩니다.
• 순환 엑소좀은 내장 및 골격근 조직 베드의 동정맥 샘플에서 파생되어 엑소좀 내 프로테옴 및 대사체, 그리고 각각의 조직 베드에서 TCA 주기 플럭스와의 관계를 결정합니다. D5-페닐알라닌의 통합은 엑소좀에서 단백질 형성을 추적하는 데 도움이 됩니다.
• 마지막으로, 내장 및 골격근 조직 베드에서 얻은 동정맥 샘플을 통해 결정된 전신 대사체 및 프로테옴의 변화도 수행되고 각각의 조직 베드에서 TCA 주기 플럭스와 상관 관계가 있습니다.