In vivo vurdering af cellulær metabolisme hos mennesker

Tricarboxyl (TCA) eller Krebs cyklus er det "centrale omdrejningspunkt for cellulær metabolisme", der finder sted i mitokondrierne. Det er en række sekventielle kemiske reaktioner, der genererer cellulær energi i form af ATP. Derudover giver cyklussen mellemmetabolitter, der bruges i biosyntesen af ​​aminosyrer og fedtsyrer samt reducerende midler såsom nikotinamid adenindinukleotid (NADH) og flavinadenindinukleotid (FADH2), der bruges i adskillige biokemiske reaktioner. Dysfunktionen i TCA-cyklussen er anerkendt for dens sammenhæng i neurodegenerative og kardiovaskulære sygdomme, metaboliske syndromer, tumorgenese og aldring. Derfor har det signifikant klinisk betydning at være i stand til at måle aktiviteten eller fluxen af ​​TCA-cyklussen enten in vitro eller in vivo. Næsten alle undersøgelser er baseret på in vitro-tilgange undtagen NMRS-baserede undersøgelser, der involverer flere ikke-validerede antagelser.

Forskellige stabile isotopmærkningsundersøgelser er blevet brugt til at estimere TCA-cyklusfluxen ved at måle en eller flere mærkede mellemmetabolitter i cyklussen. Desværre er disse mærkede mellemprodukter ofte til stede gennem kun delvise segmenter af cyklussen på grund af udveksling, anaplerose (indgang i cyklussen), kataplerose (eksport ud af cyklussen) eller ufuldstændig cykling. Selvom disse tidligere isotopmærkningsundersøgelser af TCA-cyklusfluxen var kvalitativt informative, var mange kvantitativt unøjagtige på grund af uventede fortyndinger af TCA-cyklusmellemprodukterne, der stammer fra umærkede precursorer.

Dette er et pilotstudie for at etablere en ny metodologi ved hjælp af masse-isotopomer-fluxanalyse efter infusioner af 2-13C-acetat, 2-15N-glutamin og D5-phenylalanin for at måle in vivo TCA-cyklusfluxen i væv fra mennesker. Denne undersøgelse vil samtidig bestemme validiteten af ​​at måle TCA-cyklusfluxen i væv indirekte gennem dynamiske forskelle i berigelse af mærkede TCA-cyklusmellemprodukter mellem arterielle og venøse blodforsyninger fra den pågældende vævsleje (dvs. arteriovenøs model eller A-V balanceteknik). Vi foreslår at måle hastighederne for de forskellige metaboliske reaktioner inden for TCA-cyklussen ved at spore den positionsspecifikke 13C- og 15N-overførsel mellem de mellemliggende metabolitter for at karakterisere de oxidative, anaplerotiske, kataplerotiske og udvekslingskurser på tværs af TCA-cyklussen. Brugen af ​​2-15N-glutamin vil specifikt give os mulighed for at bestemme hastigheden af ​​glutamins indtræden i cyklussen via dets omdannelse til glutamat, hvilket giver en mere nøjagtig kvantificering af TCA-fluxen.

Denne metodologi vil blive valideret i forbindelse med kontrollerede fysiologiske forstyrrelser i menneskelige undersøgelsesdeltagere, såsom lave endogene insulinniveauer alene eller i kombination med høje glukagonniveauer.

Endelig korrelative undersøgelser, der evaluerer mitokondriel aktivitet i skeletmuskelvævet, iltforbruget i skelet- og splanchnic vævsleje, rollen af ​​cirkulerende exosomer afledt af den arteriovenøse cirkulation af skelet- og splanchnic vævsleje og ændringer i hele kroppens metabolom. vil også blive udført:

• For det første vil mitokondriel respiration blive målt ved højopløsningsrespirometri (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Østrig) ved hjælp af en trinvis protokol til at evaluere forskellige komponenter i elektrontransportsystemet. Proteinindholdet i mitokondriesuspensionen vil blive målt ved hjælp af et kolorimetrisk assay (Pierce 660-nm Protein Assay). Oxygenstrømningshastigheder vil blive udtrykt pr. vævsvådvægt og pr. milligram mitokondrielt protein.
• For det andet vil reaktive oxygenarter (ROS) emissioner også blive evalueret på alle skeletmuskelvævsprøver. Kort fortalt vil et Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) spektrofluorometer med temperaturkontrol og kontinuerlig omrøring blive brugt til at overvåge Amplex Red (Invitrogen) oxidation i frisk isolerede mitokondriesuspensioner opnået fra skeletmuskelbiopsierne. Amplex Red-oxidation vil blive målt i nærvær af glutamat (10 mmol/L), malat (2 mmol/L) og succinat (10 mmol/L). Det fluorescerende signal vil blive korrigeret for baggrundsautooxidation og kalibreret til en standardkurve. H2O2-produktionshastighederne vil blive udtrykt i forhold til mitokondrielt protein.
• For det tredje vil samtidige vurderinger af iltforbruget og kuldioxidproduktionen blive bestemt ved hjælp af blodgasmålinger fra de arteriovenøse prøver opnået fra splanchnic og skeletmuskelvæv. Disse vurderinger vil blive udført på alle tre tidspunkter for blodprøvevurderinger og korreleret med den målte TCA-cyklusflux i deres respektive vævslejer.
• Cirkulerende exosomer vil også blive afledt fra de arteriovenøse prøver af splanchnic og skeletmuskelvævsleje for at bestemme dets intra-exosomproteom og metabolom og dets forhold til TCA-cyklusfluxen i deres respektive vævslejer. Inkorporering af D5-phenylalanin vil hjælpe med at spore proteindannelsen i exosomer.
• Endelig vil ændringer i hele kroppens metabolom og proteom bestemt via de arteriovenøse prøver opnået fra splanchniske og skeletmuskelvævsleje også blive udført og korreleret med TCA-cyklusfluxen i deres respektive vævsleje.