Evaluación in vivo del metabolismo celular en humanos

El tricarboxílico (TCA) o ciclo de Krebs es el "centro central del metabolismo celular" que tiene lugar dentro de las mitocondrias. Es una serie de reacciones químicas secuenciales que generan energía celular en forma de ATP. Además, el ciclo proporciona metabolitos intermedios que se utilizan en la biosíntesis de aminoácidos y ácidos grasos, así como agentes reductores como el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) y el dinucleótido de flavina y adenina (FADH2) que se utilizan en numerosas reacciones bioquímicas. La disfunción del ciclo TCA es reconocida por su asociación en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, síndromes metabólicos, tumorigénesis y envejecimiento. Por lo tanto, poder medir la actividad o el flujo del ciclo TCA in vitro o in vivo tiene una importancia clínica significativa. Casi todos los estudios se basan en enfoques in vitro, excepto los estudios basados ​​en NMRS que involucran múltiples suposiciones no validadas.

Se han utilizado varios estudios de marcado de isótopos estables para estimar el flujo del ciclo de TCA midiendo uno o más metabolitos intermedios marcados dentro del ciclo. Desafortunadamente, estos productos intermedios etiquetados a menudo están presentes solo en segmentos parciales del ciclo debido al intercambio, anaplerosis (entrada en el ciclo), cataplerosis (exportación fuera del ciclo) o ciclos incompletos. Aunque estos estudios previos de etiquetado de isótopos del flujo del ciclo TCA fueron cualitativamente informativos, muchos fueron cuantitativamente inexactos debido a diluciones inesperadas de los intermedios del ciclo TCA que surgen de precursores no marcados.

Este es un estudio piloto para establecer una metodología novedosa que utiliza el análisis de flujo de isotopómeros en masa después de infusiones de 2-13C-acetato, 2-15N-glutamina y D5-fenilalanina para medir el flujo del ciclo TCA in vivo en tejidos de seres humanos. Este estudio determinará simultáneamente la validez de medir el flujo del ciclo TCA en el tejido indirectamente a través de las diferencias dinámicas en el enriquecimiento de los intermedios del ciclo TCA marcados entre los suministros de sangre arterial y venosa de ese lecho de tejido en particular (es decir, modelo arteriovenoso o técnica de equilibrio A-V). Proponemos medir las tasas de las diferentes reacciones metabólicas dentro del ciclo TCA rastreando la transferencia de 13C y 15N específica de la posición entre los metabolitos intermedios para caracterizar las tasas oxidativas, anapleróticas, catapleróticas y de intercambio a lo largo del ciclo TCA. El uso de 2-15N-Glutamina nos permitirá específicamente determinar la tasa de entrada de glutamina en el ciclo a través de su conversión a glutamato, proporcionando así una cuantificación más precisa del flujo de TCA.

Esta metodología se validará en el contexto de perturbaciones fisiológicas controladas en los participantes humanos del estudio, como niveles bajos de insulina endógena sola o en combinación con niveles altos de glucagón.

Finalmente, estudios correlativos que evalúan la actividad mitocondrial en el tejido muscular esquelético, el consumo de oxígeno en los lechos de tejido esquelético y esplácnico, el papel de los exosomas circulantes derivados de la circulación arteriovenosa de los lechos de tejido esquelético y esplácnico y los cambios en el metaboloma de todo el cuerpo. también se realizará:

• En primer lugar, se medirá la respiración mitocondrial mediante respirometría de alta resolución (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) mediante un protocolo paso a paso para evaluar varios componentes del sistema de transporte de electrones. El contenido de proteínas de la suspensión mitocondrial se medirá mediante un ensayo colorimétrico (ensayo de proteínas de 660 nm de Pierce). Las tasas de flujo de oxígeno se expresarán por peso de tejido húmedo y por miligramo de proteína mitocondrial.
• En segundo lugar, también se evaluarán las emisiones de especies reactivas de oxígeno (ROS) en todas las muestras de tejido muscular esquelético. Brevemente, se utilizará un espectrofluorómetro Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) con control de temperatura y agitación continua para monitorear la oxidación de Amplex Red (Invitrogen) en suspensiones mitocondriales recién aisladas obtenidas de las biopsias del músculo esquelético. La oxidación de Amplex Red se medirá en presencia de glutamato (10 mmol/L), malato (2 mmol/L) y succinato (10 mmol/L). La señal fluorescente se corregirá para la autooxidación de fondo y se calibrará a una curva estándar. Las tasas de producción de H2O2 se expresarán en relación con la proteína mitocondrial.
• En tercer lugar, se determinarán las evaluaciones simultáneas del consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono a través de mediciones de gases en sangre de las muestras arteriovenosas obtenidas de los lechos de tejido muscular esplácnico y esquelético. Estas evaluaciones se realizarán en los tres puntos temporales de las evaluaciones de muestras de sangre y se correlacionarán con el flujo del ciclo de TCA medido en sus respectivos lechos de tejido.
• Los exosomas circulantes también se derivarán de las muestras arteriovenosas de los lechos de tejido muscular esplácnico y esquelético para determinar su proteoma y metaboloma intraexosoma y su relación con el flujo del ciclo TCA en sus respectivos lechos tisulares. La incorporación de D5-fenilalanina ayudará a rastrear la formación de proteínas en los exosomas.
• Finalmente, los cambios en el metaboloma y el proteoma de todo el cuerpo determinados a través de las muestras arteriovenosas obtenidas de los lechos de tejido del músculo esplácnico y esquelético también se realizarán y correlacionarán con el flujo del ciclo TCA en sus respectivos lechos de tejido.