Évaluation in vivo du métabolisme cellulaire chez l'homme

Le cycle tricarboxylique (TCA) ou cycle de Krebs est le "moyeu central du métabolisme cellulaire" qui se déroule dans les mitochondries. C'est une série de réactions chimiques séquentielles qui génèrent de l'énergie cellulaire sous forme d'ATP. De plus, le cycle fournit des métabolites intermédiaires qui sont utilisés dans la biosynthèse des acides aminés et des acides gras ainsi que des agents réducteurs tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et la flavine adénine dinucléotide (FADH2) qui sont utilisés dans de nombreuses réactions biochimiques. Le dysfonctionnement du cycle TCA est reconnu pour son association dans les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires, les syndromes métaboliques, la tumorigenèse et le vieillissement. Par conséquent, être capable de mesurer l'activité ou le flux du cycle TCA in vitro ou in vivo revêt une importance clinique significative. Presque toutes les études sont basées sur des approches in vitro, à l'exception des études basées sur le NMRS qui impliquent de multiples hypothèses non validées.

Diverses études de marquage des isotopes stables ont été utilisées pour estimer le flux du cycle TCA en mesurant un ou plusieurs métabolites intermédiaires marqués dans le cycle. Malheureusement, ces intermédiaires marqués ne sont souvent présents que sur des segments partiels du cycle en raison d'un échange, d'une anaplérose (entrée dans le cycle), d'une cataplérose (exportation hors du cycle) ou d'un cycle incomplet. Bien que ces précédentes études de marquage isotopique du flux du cycle TCA aient été qualitativement informatives, beaucoup étaient quantitativement inexactes en raison de dilutions inattendues des intermédiaires du cycle TCA provenant de précurseurs non marqués.

Il s'agit d'une étude pilote visant à établir une nouvelle méthodologie utilisant l'analyse du flux de masse isotopomère après des perfusions de 2-13C-acétate, 2-15N-glutamine et D5-phénylalanine pour mesurer le flux du cycle TCA in vivo dans les tissus d'êtres humains. Cette étude déterminera simultanément la validité de la mesure indirecte du flux du cycle TCA dans les tissus par le biais de différences dynamiques d'enrichissement des intermédiaires du cycle TCA marqués entre les apports sanguins artériel et veineux de ce lit tissulaire particulier (c.-à-d. modèle artério-veineux ou technique d'équilibre A-V). Nous proposons de mesurer les taux des différentes réactions métaboliques au sein du cycle du TCA en traçant le transfert de 13C et de 15N spécifique à la position entre les métabolites intermédiaires afin de caractériser les taux d'oxydation, d'anaplérose, de cataplérose et d'échange à travers le cycle du TCA. L'utilisation de 2-15N-Glutamine nous permettra spécifiquement de déterminer le taux d'entrée de la glutamine dans le cycle via sa conversion en glutamate, fournissant ainsi une quantification plus précise du flux de TCA.

Cette méthodologie sera validée dans le cadre de perturbations physiologiques contrôlées chez les participants humains à l'étude, telles que de faibles niveaux d'insuline endogène seuls ou en combinaison avec des niveaux élevés de glucagon.

Enfin, des études corrélatives évaluant l'activité mitochondriale dans le tissu musculaire squelettique, la consommation d'oxygène dans les lits tissulaires squelettiques et splanchniques, le rôle des exosomes circulants issus de la circulation artério-veineuse des lits tissulaires squelettiques et splanchniques et les modifications du métabolome du corps entier seront également exécutés :

• Tout d'abord, la respiration mitochondriale sera mesurée par respirométrie à haute résolution (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche) en utilisant un protocole par étapes pour évaluer divers composants du système de transport d'électrons. La teneur en protéines de la suspension mitochondriale sera mesurée à l'aide d'un test colorimétrique (Pierce 660-nm Protein Assay). Les taux de flux d'oxygène seront exprimés par poids de tissu humide et par milligramme de protéine mitochondriale.
• Deuxièmement, les émissions d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) seront également évaluées sur tous les échantillons de tissus musculaires squelettiques. En bref, un spectrofluorimètre Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) avec contrôle de la température et agitation continue sera utilisé pour surveiller l'oxydation de l'Amplex Red (Invitrogen) dans des suspensions mitochondriales fraîchement isolées obtenues à partir des biopsies du muscle squelettique. L'oxydation de l'Amplex Red sera mesurée en présence de glutamate (10 mmol/L), de malate (2 mmol/L) et de succinate (10 mmol/L). Le signal fluorescent sera corrigé pour l'auto-oxydation de fond et calibré sur une courbe standard. Les taux de production de H2O2 seront exprimés par rapport à la protéine mitochondriale.
• Troisièmement, des évaluations simultanées de la consommation d'oxygène et de la production de dioxyde de carbone seront déterminées par des mesures de gaz sanguins à partir d'échantillons artério-veineux obtenus à partir des lits de tissus musculaires splanchniques et squelettiques. Ces évaluations seront effectuées aux trois points temporels des évaluations des échantillons de sang et corrélées avec le flux de cycle de TCA mesuré dans leurs lits de tissus respectifs.
• Des exosomes circulants seront également dérivés des échantillons artério-veineux des lits de tissus musculaires splanchniques et squelettiques pour déterminer son protéome et son métabolome intra-exosome et sa relation avec le flux du cycle TCA dans leurs lits de tissus respectifs. L'incorporation de D5-phénylalanine aidera à tracer la formation de protéines dans les exosomes.
• Enfin, des changements dans le métabolome et le protéome du corps entier déterminés via les échantillons artério-veineux obtenus à partir des lits de tissus musculaires splanchniques et squelettiques seront également effectués et corrélés avec le flux du cycle TCA dans leurs lits de tissus respectifs.