In vivo beoordeling van cellulair metabolisme bij mensen

De tricarboxylic (TCA) of Krebs-cyclus is de "centrale hub van cellulair metabolisme" die plaatsvindt in de mitochondriën. Het is een reeks opeenvolgende chemische reacties die cellulaire energie genereren in de vorm van ATP. Bovendien levert de cyclus intermediaire metabolieten die worden gebruikt bij de biosynthese van aminozuren en vetzuren, evenals reductiemiddelen zoals nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH) en flavine-adenine-dinucleotide (FADH2) die in tal van biochemische reacties worden gebruikt. De disfunctie van de TCA-cyclus wordt erkend vanwege zijn associatie met neurodegeneratieve en cardiovasculaire ziekten, metabole syndromen, tumorvorming en veroudering. Daarom is het van significant klinisch belang om de activiteit of flux van de TCA-cyclus in vitro of in vivo te kunnen meten. Bijna alle onderzoeken zijn gebaseerd op in vitro-benaderingen, behalve op NMRS gebaseerde onderzoeken die meerdere niet-gevalideerde aannames bevatten.

Er zijn verschillende onderzoeken naar stabiele isotopenlabeling gebruikt om de TCA-cyclusflux te schatten door een of meer gelabelde intermediaire metabolieten binnen de cyclus te meten. Helaas zijn deze gelabelde tussenproducten vaak slechts in gedeeltelijke segmenten van de cyclus aanwezig als gevolg van uitwisseling, anaplerose (toegang tot de cyclus), katapulrose (export uit de cyclus) of onvolledige cyclus. Hoewel deze eerdere isotoop-labelstudies van de TCA-cyclusflux kwalitatief informatief waren, waren vele kwantitatief onnauwkeurig vanwege onverwachte verdunningen van de TCA-cyclus-tussenproducten die voortkwamen uit niet-gelabelde voorlopers.

Dit is een pilootstudie om een ​​nieuwe methodologie vast te stellen met behulp van massa-isotopomeerfluxanalyse na infusies van 2-13C-acetaat, 2-15N-glutamine en D5-fenylalanine om de in vivo TCA-cyclusflux in menselijke weefsels te meten. Deze studie zal tegelijkertijd de validiteit bepalen van het indirect meten van de TCA-cyclusflux in weefsel door dynamische verschillen in verrijking van gelabelde TCA-cyclustussenproducten tussen arteriële en veneuze bloedtoevoer van dat specifieke weefselbed (d.w.z. arterioveneus model of A-V-balanstechniek). We stellen voor om de snelheden van de verschillende metabolische reacties binnen de TCA-cyclus te meten door de positiespecifieke 13C- en 15N-overdracht tussen de intermediaire metabolieten te volgen om de oxidatieve, anaplerotische, kataplerotische en wisselkoersen over de TCA-cyclus te karakteriseren. Het gebruik van 2-15N-Glutamine stelt ons in het bijzonder in staat om de snelheid te bepalen waarmee glutamine in de cyclus komt via de omzetting ervan in glutamaat, waardoor een nauwkeurigere kwantificering van de TCA-flux wordt verkregen.

Deze methodologie zal worden gevalideerd in de setting van gecontroleerde fysiologische verstoringen bij menselijke studiedeelnemers, zoals lage endogene insulinespiegels alleen of in combinatie met hoge glucagonspiegels.

Ten slotte, correlatieve studies die de mitochondriale activiteit in het skeletspierweefsel evalueren, het zuurstofverbruik in de skelet- en splanchnische weefselbedden, de rol van circulerende exosomen afgeleid van de arterioveneuze circulatie van de skelet- en splanchnische weefselbedden en de veranderingen in het metaboloom van het hele lichaam wordt ook uitgevoerd:

• Ten eerste zal de mitochondriale ademhaling worden gemeten met hoge resolutie respirometrie (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk) met behulp van een stapsgewijs protocol om verschillende componenten van het elektronentransportsysteem te evalueren. Het eiwitgehalte van de mitochondriale suspensie zal worden gemeten met behulp van een colorimetrische assay (Pierce 660-nm Protein Assay). Zuurstoffluxsnelheden worden uitgedrukt per nat weefselgewicht en per milligram mitochondriaal eiwit.
• Ten tweede zullen ook de emissies van reactieve zuurstofspecies (ROS) worden geëvalueerd op alle monsters van skeletspierweefsel. In het kort zal een Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) spectrofluorometer met temperatuurregeling en continu roeren worden gebruikt om Amplex Red (Invitrogen) oxidatie te monitoren in vers geïsoleerde mitochondriale suspensies verkregen uit de skeletspierbiopten. De oxidatie van Amplex Red wordt gemeten in aanwezigheid van glutamaat (10 mmol/L), malaat (2 mmol/L) en succinaat (10 mmol/L). Het fluorescerende signaal wordt gecorrigeerd voor auto-oxidatie op de achtergrond en gekalibreerd op een standaardcurve. De H2O2-productiesnelheden zullen worden uitgedrukt ten opzichte van mitochondriaal eiwit.
• Ten derde zullen gelijktijdige beoordelingen van het zuurstofverbruik en de koolstofdioxideproductie worden bepaald door middel van bloedgasmetingen uit de arterioveneuze monsters verkregen uit de splanchnische en skeletspierweefselbedden. Deze beoordelingen worden uitgevoerd op alle drie de tijdstippen van bloedmonsterbeoordelingen en worden gecorreleerd met de gemeten TCA-cyclusflux in hun respectieve weefselbedden.
• Circulerende exosomen zullen ook worden afgeleid van de arterioveneuze monsters van de splanchnische en skeletspierweefselbedden om het intra-exosoom proteoom en metaboloom en de relatie met de TCA-cyclusflux in hun respectieve weefselbedden te bepalen. Opname van D5-fenylalanine zal helpen bij het traceren van de eiwitvorming in de exosomen.
• Ten slotte zullen ook veranderingen in het metaboloom en proteoom van het hele lichaam, bepaald via de arterioveneuze monsters verkregen uit de splanchnische en skeletspierweefselbedden, worden uitgevoerd en gecorreleerd met de TCA-cyclusflux in hun respectieve weefselbedden.