Ocena in vivo metabolizmu komórkowego u ludzi

Cykl trikarboksylowy (TCA) lub cykl Krebsa to „centralne centrum metabolizmu komórkowego”, które zachodzi w mitochondriach. Jest to seria kolejnych reakcji chemicznych, które generują energię komórkową w postaci ATP. Ponadto cykl dostarcza metabolitów pośrednich, które są wykorzystywane w biosyntezie aminokwasów i kwasów tłuszczowych, a także czynników redukujących, takich jak dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FADH2), które są wykorzystywane w wielu reakcjach biochemicznych. Dysfunkcja cyklu TCA jest uznawana za jej związek z chorobami neurodegeneracyjnymi i sercowo-naczyniowymi, zespołami metabolicznymi, powstawaniem nowotworów i starzeniem. W związku z tym możliwość pomiaru aktywności lub przepływu cyklu TCA in vitro lub in vivo ma istotne znaczenie kliniczne. Prawie wszystkie badania opierają się na podejściach in vitro, z wyjątkiem badań opartych na NMRS, które obejmują wiele niepotwierdzonych założeń.

Zastosowano różne badania znakowania stabilnymi izotopami do oszacowania przepływu cyklu TCA poprzez pomiar jednego lub więcej znakowanych metabolitów pośrednich w cyklu. Niestety, te oznakowane półprodukty są często obecne tylko w częściowych segmentach cyklu z powodu wymiany, anaplerozy (wejście do cyklu), kataplerozy (eksport z cyklu) lub niepełnego cyklu. Chociaż te poprzednie badania znakowania izotopowego strumienia cyklu TCA były jakościowo pouczające, wiele z nich było niedokładnych ilościowo z powodu nieoczekiwanych rozcieńczeń półproduktów cyklu TCA wynikających z nieznakowanych prekursorów.

Jest to badanie pilotażowe mające na celu ustanowienie nowej metodologii wykorzystującej analizę strumienia masy izotopomerów po infuzjach 2-13C-octanu, 2-15N-glutaminy i D5-fenyloalaniny do pomiaru przepływu cyklu TCA in vivo w tkankach ludzkich. Badanie to jednocześnie określi zasadność pomiaru strumienia cyklu TCA w tkance pośrednio poprzez dynamiczne różnice we wzbogaceniu znakowanych półproduktów cyklu TCA między zaopatrzeniem krwi tętniczej i żylnej w tym konkretnym łożysku tkankowym (tj. model tętniczo-żylny lub technika równowagi AV). Proponujemy zmierzyć szybkość różnych reakcji metabolicznych w cyklu TCA, śledząc specyficzny dla pozycji transfer 13C i 15N między pośrednimi metabolitami w celu scharakteryzowania szybkości utleniania, anaplerotyki, kataplerotyki i wymiany w całym cyklu TCA. Zastosowanie 2-15N-glutaminy w szczególności pozwoli nam określić szybkość wejścia glutaminy do cyklu poprzez jej konwersję do glutaminianu, zapewniając w ten sposób dokładniejsze określenie ilościowe strumienia TCA.

Ta metodologia zostanie zweryfikowana w warunkach kontrolowanych zaburzeń fizjologicznych u uczestników badania na ludziach, takich jak niski poziom endogennej insuliny, sam lub w połączeniu z wysokim poziomem glukagonu.

Wreszcie badania korelacyjne oceniające aktywność mitochondriów w tkance mięśni szkieletowych, zużycie tlenu w łożyskach tkanek szkieletowych i trzewnych, rolę krążących egzosomów pochodzących z krążenia tętniczo-żylnego w łożyskach tkanek szkieletowych i trzewnych oraz zmiany w całym metabolizmie organizmu wykonane zostaną również:

• Po pierwsze, oddychanie mitochondrialne będzie mierzone za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) przy użyciu stopniowego protokołu do oceny różnych elementów systemu transportu elektronów. Zawartość białka w zawiesinie mitochondrialnej będzie mierzona przy użyciu testu kolorymetrycznego (Pierce 660-nm Protein Assay). Natężenia przepływu tlenu zostaną wyrażone na masę mokrej tkanki i na miligram białka mitochondrialnego.
• Po drugie, emisja reaktywnych form tlenu (ROS) zostanie również oceniona we wszystkich próbkach tkanki mięśni szkieletowych. W skrócie, spektrofluorometr Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon) z kontrolą temperatury i ciągłym mieszaniem będzie używany do monitorowania utleniania czerwieni Amplex (Invitrogen) w świeżo wyizolowanych zawiesinach mitochondrialnych uzyskanych z biopsji mięśni szkieletowych. Utlenianie Amplex Red będzie mierzone w obecności glutaminianu (10 mmol/l), jabłczanu (2 mmol/l) i bursztynianu (10 mmol/l). Sygnał fluorescencyjny zostanie skorygowany pod kątem autoutleniania tła i skalibrowany do krzywej wzorcowej. Szybkość produkcji H2O2 zostanie wyrażona w stosunku do białka mitochondrialnego.
• Po trzecie, równoczesna ocena zużycia tlenu i produkcji dwutlenku węgla zostanie określona za pomocą pomiarów gazometrii krwi z próbek tętniczo-żylnych pobranych z łożysk tkanki mięśni trzewnych i szkieletowych. Oceny te zostaną przeprowadzone we wszystkich trzech punktach czasowych oceny próbek krwi i skorelowane ze zmierzonym przepływem cyklu TCA w odpowiednich łożach tkankowych.
• Krążące egzosomy będą również pochodzić z tętniczo-żylnych próbek łożysk tkanki trzewnej i mięśni szkieletowych, aby określić jego proteom i metabolom wewnątrz egzosomu oraz jego związek z przepływem cyklu TCA w odpowiednich łożyskach tkankowych. Włączenie D5-fenyloalaniny pomoże śledzić powstawanie białek w egzosomach.
• Na koniec zostaną również przeprowadzone zmiany w metabolomie i proteomie całego ciała określone za pomocą próbek tętniczo-żylnych pobranych z łożysk tkanki trzewnej i mięśni szkieletowych i skorelowane z przepływem cyklu TCA w odpowiednich łożyskach tkankowych.