ヒト幹細胞を用いたパーキンソン脳の修復 (HSCfPD)

この試験は、PDの治療のための未分化hfSCの被殻内移植の安全性と潜在的な有効性を第一にテストするために設計された、縦断的、前向き、介入的、非対照研究です。 患者は、副作用がないか注意深く監視されました。 すべての患者は、ベースラインと手術後 6 か月および 12 か月の神経学的、神経心理学的、MRI、および PET 評価を受けました。

hfSC の調達、分離、拡大、および特徴付け、ならびに hfSC 移植に対する患者の免疫応答の評価は、Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA USA) で実施されました。 患者の選択、手術前後の神経学的、神経心理学的、および MRI 評価、ならびに定位手術および手術後のケアは、アンヘレス デル ペドレガル病院 (メキシコシティ、メキシコ) で実施されました。 放射性医薬品の合成と PET イメージングは​​、メキシコ国立自治大学医学部の放射性医薬品サイクロトロン ユニット (メキシコシティ、メキシコ) で実施されました。 中等度から高度の PD 患者 8 人がこの試験に選ばれました。 患者の 1 人は、この研究とは関係のない理由でフォローアップできなくなりました。 経過観察を完了した被験者は、女性 2 名、男性 5 名で、年齢は 43 ～ 74 歳 (平均年齢 56 歳) でした。

hfSCの調達と拡大

ヒト胎児脳組織は、胎児組織の使用に関する NIH ガイドラインおよび連邦法および州法に従って、ドナーからのインフォームド コンセントを得た通常の無菌手動吸引法によって調達されました。 組織ドナーと hfSC 受信者は、お互いに不明なままでした。

母体の血液サンプル (血清) は、以下について検査されました。 HTLVI (アボット); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test and reflex FTA)、およびサイトメガロウイルス (Quest、Oxnard CA)。 性器ヘルペス、がん、喘息、狼瘡、関節リウマチ、アレルギー、自己免疫起源の血管炎、および薬物乱用の病歴を持つ女性は除外されました。 妊娠はカーネギーステージに従って決定されました。 選択的中絶後、妊娠 6 週目に胎児組織を採取しました。 胎児の脳を解剖し、みじん切りにし、粉砕して単一細胞懸濁液にした。 細胞は、低酸素条件下（5% O2 および 5% CO2）で 37°C で 4 回の倍加を経て培養されたフラスコで培養されました。 2 回目の倍加 (D2) で細胞培養の無菌性をテストし (USP <71>)、D4 で培養の核型を調べ、外来因子の存在について PCR をテストしました: HTLV-1、HTLV-2、HIV-1 (A、B、 D、F、H、N)、A型、B型およびC型肝炎、T. p.淡蒼球、CMV、HSV-1、HSV-2、HPV。 次いで、細胞を、同じ物理的および化学的条件下で操作する閉鎖バイオリアクターシステム（GE WAVE Bioreactor 2/10 System、Uppsala SWE）に移した。 バイオリアクターを使用してマスター セル バンク (MCB) を作成し、合計 7 回の倍加 (D7) の後に採取、テスト、特徴付け、速度制御凍結保存を行いました。

MCB の安全性テストと特性評価を行った後、バッチの一部を解凍し、ワーキング セル バンク (WCB) 生産用のバイオリアクターに播種するために使用しました。 D13に達するまで細胞をバイオリアクターで培養した。 それらを収穫し（Centritech LAB-III、Carr Centritech Separation System、Rancho Cucamonga、CA、USA）、等分し（Fill-It; TAP Biosystems、Wilmington、DE、USA）、凍結保存して WCB を作成しました。 WCB は、安全性および特性評価アッセイのためにリリース テストを受けました。 安全性試験には、無菌性 (USP <71>)、マイコプラズマ (USP <63)、エンドトキシン (USP <85>)、および核型分析 (Cell Line Genetics, Madison WI, USA) が含まれます。 特徴付けには以下のフローサイトメトリー検査が含まれます: Oct-4 >90% (10H11.2、 EMD ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国。 AF488 共役)、Sox-2 >90% (Btjce、eBioscience、サンディエゴ CA、USA; AF488 共役)、MHC-I <10% (A4、eBioscience; APC 共役)、MHC-II <10% (CVS20、Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488 共役)、CD105 <10% (SN6, eBioscience; PE-Cy7 共役)、チロシンヒドロキシラーゼ <10% (EP1532Y, Abcam, Cambridge, UK; FITC 共役ヤギ抗ウサギ IgG; Abcam ; ポリクローナル)。 MCB と WCB の両方を、-196°C の気相 LN2 で保存しました。

すべての手順は、検証済みのプロトコルに従って、ISO 5 バイオセーフティキャビネットと層流フードを利用して、ISO 8 クリーンルームで無菌条件下で実施されました。 細胞は正常な核型を持つことが示され、免疫不全のげっ歯類では奇形腫を生成しませんでした (未発表データ)。

薬物療法

15 mg/kg/日の用量のシクロスポリン A による免疫抑制は、手術の 10 日前に開始され、その後 1 か月間継続されました。 患者はまた、移植の 10 日前から開始し、その後 6 か月間、インドメタシン 225mg/日を投与されました。 広範囲の抗生物質 (Zannat 700mg) が術前と術後 48 時間に投与されました。 抗パーキンソン病薬は、患者の要求に合わせて調整されました。

定位手術

PD 患者への MRI 誘導定位被殻内細胞移植は、Leksell 定位システムおよび Stealth Station Surgical Navigation System (米国ミネソタ州フリドリー) を使用して実施されました。 ロピバカインは、フレーム配置のための局所麻酔薬として使用されました。 ターゲット位置については、以前の MR 画像と融合された CT スキャン画像を使用して測定が行われました (どちらも DICOM 形式で、厚さ 1.0 mm のアキシャル セクション)。 全身麻酔下の患者で、メイフィールド ヘッド ホルダーを使用して定位フレームを手術台に固定しました。 細胞懸濁液注射の準備として、両側傍矢状切開および対応する 14 mm 穿頭孔 (各半球に 1 つ) を作成しました。 同じ穿頭孔を通る 2 つの異なる針跡が各側に選択されました。 ターゲット位置は、被殻核の高さと長さによって決定されました。 各トラックの最も低い Z 座標は背側の被殻にあり、X 方向に 4 mm 離れていました。 各ニードル トラックは、1 cc の培地で 1 × 106 個の細胞を受け取りました。 完全な細胞懸濁液の送達を確実にするために、幹細胞と脳組織への損傷の両方を回避し、逆流または気泡形成を回避するために、送達針を相互に引き抜きながら2分間ゆっくりと注射を行いました。 手術後、患者は従来の術後ケアユニットに1時間収容されました。 手術の翌日、細胞懸濁液の正しい配置を確認するために MR 画像が得られました。 すべての患者は、手術後 24 時間で退院しました。

神経学的評価

この研究の神経学的エンドポイントには、細胞移植後の有害事象の数と重症度の評価、およびUPDRSパートI（精神、行動および気分）、パートII（運動活動）で評価される運動反応の改善における有効性が含まれます。日常生活）、パートIII（運動能力）、パートIV（治療の合併症）、および修正されたHöehn and Yahr Scale、および修正されたSchwab and England Activities of Daily Living Scale。 患者は、スクリーニング時 (ベースラインとして、手術前) にこれらのスケールを使用して臨床的に評価され、その後、6 か月および 12 か月の手順で評価されました。 受診のたびに、UPDRS 評価の少なくとも 12 時間前に抗パーキンソン病薬を中止するように患者に依頼し (実際には、「オフ」状態は一晩の薬物離脱と定義した)、「オフ」状態で評価した後、UPDRS 「オン」投薬評価は、レボドパの通常用量を受け取ってから 1 時間後に行った。 各患者は、各評価で術前に同じレボドパを投与されました。 患者が自発的に報告した有害事象および評価中に観察された有害事象を記録した。 研究を完了したすべての患者から署名されたインフォームド コンセントを得た後、すべての「オフ」および「オン」の UPDRS 評価がビデオに録画されました。

神経心理学的評価

認知能力は、次の手段を使用して評価されました。ベックとステアの不安 [25] およびうつ病 [26] インベントリのメキシコ適応。私たちの簡単な神経心理学的（NEUROPSI）[27,28]およびコンピューター化された神経心理学的テストバッテリー、およびMini-mental Parkinson State Examination（MMPSE）[29]。 患者は、日常生活活動に関連する生活の質を報告しました。身体的および精神的幸福（健康状態）;認知とコミュニケーション、および 1 つの要約インデックス。

免疫原性試験

患者の血液を、ベースライン値と比較して、hfSC 特異的抗体の力価の増加、および移植後の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の増加について評価しました。 サンプルは、細胞移植の 1 か月前に採取され、手術の 1 か月後と 6 か月後に採取されました。 各患者から全血標本を採取し、フローサイトメトリーによる免疫応答における細胞追跡および細胞毒性アッセイについてメーカーが説明したように、親油性膜色素 PKH67 (Sigma-Aldrich) を使用して、移植後 1 か月および 6 か月の血清として処理した [30, 31]。 細胞毒性アッセイは、100:1、50:1、および 25:1 のエフェクターとターゲットの比率で実行されました。

MRI

MR 画像は、手術前 (ベースライン) と、細胞移植後 24 時間で 3 回、手術後 6 か月および 12 か月で取得されました。 それらは 3 テスラの磁石、MR Systems Achieva リリース 2.6.3.8 で取得されました。 Philips (ベスト、オランダ)。

PET分子イメージング

患者は、ベースライン時、6 か月後 (データは提示されていません)、hfSC 移植の 1 年後に PET 分子イメージングを受けました。 使用した放射性医薬品は、(+)-α-[11C]ジヒドロテトラベナジン (DTBZ)、6-[18F]フルオロ-L-DOPA (FDOPA)、および [11C]ラクロプリド (RAC) でした。 すべての患者は、少なくとも 1 週間の間隔を空けて、DTBZ-PET スキャンと FDOPA または RAC のいずれかを使用した 1 つの追加の研究を受けました。 患者は、各研究の少なくとも 12 時間前に抗パーキンソン病薬を中止するよう求められました。 Siemens Biograph 64 PET/CTでスキャンを取得しました。 30 分間の脳放射スキャンは、DTBZ または RAC の注射の 20 分後に取得されましたが、FDOPA については、注射の 75 分後に 15 分間のスキャンが取得されました。 FDOPAで研究されたすべての患者は、末梢の脱炭酸を防ぐために150mgのカルビドパで前投薬されました。 OSEM-2D アルゴリズムを使用して画像を再構成し、ソフトウェア統計パラメトリック マッピング (SPM v.12) で分析しました。 個々の PET 脳画像は、解剖学的 MRI アトラスで正規化され、標準空間内で評価されました。 正規化に続いて、関心領域の定義に FSL 構造アトラスが使用されました。 定量分析を容易にするために、線条体活動から非特異的取り込みを伴う参照領域のバックグラウンドシグナルを差し引き、参照領域の活動[（ターゲット取り込み - 参照取り込み）/参照取り込み]、参照領域として後頭皮質 (DTBZ および FDOPA) と小脳 (RAC) を使用します。

統計分析

不安、うつ病、NEUROPSI、MMPSE 検査、「オン」および「オフ」投薬状態での右と左の指のタッピングのベースラインと 12 か月の追跡測定の比較は、ウィルコクソン テストを使用して実行されました。 他のすべての最終測定値は、各患者の個別の結果として報告されました。