Parkinson-hersenherstel met behulp van menselijke stamcellen (HSCfPD)

Dit onderzoek is een longitudinaal, prospectief, interventioneel, ongecontroleerd onderzoek dat is opgezet om ten eerste de veiligheid en ten tweede de potentiële werkzaamheid te testen van intrautaminale transplantatie van ongedifferentieerd hfSC voor de behandeling van PD. Patiënten werden zorgvuldig gecontroleerd op eventuele bijwerkingen. Alle patiënten ondergingen neurologische, neuropsychologische, MRI- en PET-evaluaties bij aanvang en 6 en 12 maanden na de operatie.

Aankoop, isolatie, uitbreiding en karakterisering van hfSC, evenals beoordeling van de immuunrespons van patiënten op hfSC-transplantatie, werden uitgevoerd bij Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA, VS). Patiëntselectie, pre- en postoperatieve neurologische, neuropsychologische en MRI-evaluaties, evenals stereotactische chirurgie en postoperatieve zorg werden uitgevoerd in Hospital Angeles del Pedregal (Mexico City, Mexico). Synthese van radiofarmaceutica en PET-beeldvorming werden uitgevoerd in de Radiofarmacie-Cyclotron-eenheid van de Faculteit der Geneeskunde, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexico-Stad, Mexico). Acht patiënten met matige tot gevorderde PD werden geselecteerd voor deze studie. Een van de patiënten kon niet worden opgevolgd vanwege redenen die geen verband hielden met deze studie. Onderwerpen die de follow-up voltooiden, waren 2 vrouwen en 5 mannen, met een leeftijd variërend van 43-74 jaar (gemiddelde leeftijd 56 jaar).

Aankoop en uitbreiding van hfSC

Menselijk foetaal hersenweefsel werd verkregen via routinematige steriele handmatige aspiratiemethoden met geïnformeerde toestemming van de donor in overeenstemming met de NIH-richtlijnen voor het gebruik van foetaal weefsel en met federale en staatswetten. Weefseldonor en hfSC-ontvangers bleven elkaar onbekend.

Maternale bloedmonsters (sera) werden getest op: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, VS) hepatitis A, B en C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test en reflex FTA) en cytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Vrouwen met een voorgeschiedenis van genitale herpes, kanker, astma, lupus, reumatoïde artritis, allergieën, auto-immune vasculitis en drugsmisbruik werden uitgesloten. De draagtijd werd bepaald volgens Carnegie-stadia. Foetaal weefsel werd geoogst in de zesde week van de zwangerschap na electieve abortus. Foetale hersenen werden ontleed, fijngehakt en getritureerd tot een enkele celsuspensie. Cellen werden gekweekt in kolven geïncubeerd bij 37°C onder hypoxische omstandigheden (5% O2 en 5% C02) tot 4 verdubbelingen. Bij de tweede verdubbeling (D2) werd de celkweek getest op steriliteit (USP <71>) en bij D4 werd de kweek gekaryotypeerd en PCR getest op de aanwezigheid van adventieve agentia: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatitis A, B en C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Cellen werden vervolgens overgebracht naar een gesloten bioreactorsysteem (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), werkend onder dezelfde fysische en chemische omstandigheden. De bioreactor werd gebruikt om de Master Cell Bank (MCB) te creëren, die na in totaal zeven verdubbelingen werd geoogst, getest, gekarakteriseerd en met snelheidsregeling gecryopreserveerd (D7).

Nadat de MCB op veiligheid was getest en gekarakteriseerd, werd een deel van de batch ontdooid en gebruikt om de bioreactor te zaaien voor de productie van de Working Cell Bank (WCB). Cellen werden in de bioreactor gekweekt totdat ze D13 bereikten. Ze werden geoogst (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, VS), in porties verdeeld (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, VS) en gecryopreserveerd om een ​​WCB te creëren. De WCB werd onderworpen aan vrijgavetesten voor veiligheids- en karakteriseringstesten. Veiligheidstesten omvatten steriliteit (USP <71>), mycoplasma (USP <63), endotoxine (USP <85>) en karyotypering (Cell Line Genetics, Madison WI, VS). Karakterisering omvatte flowcytometrietesten voor: 4 okt >90% (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, VS; AF488 geconjugeerd), Sox-2 >90% (Btjce, eBioscience, San Diego CA, VS; AF488 geconjugeerd), MHC-I <10% (A4, eBioscience; APC geconjugeerd), MHC-II <10% (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, VS; AF488 geconjugeerd), CD105 <10% (SN6, eBioscience; PE-Cy7 geconjugeerd) en tyrosinehydroxylase <10% (EP1532Y, Abcam, Cambridge, VK; FITC-geconjugeerd geit-anti-konijn IgG; Abcam ; polyklonaal). Zowel MCB als WCB werden opgeslagen in gasfase LN2 bij -196°C.

Alle procedures werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden in een ISO 8 cleanroom, met ISO 5 bioveiligheidskasten en laminaire luchtstroomkappen, volgens gevalideerde protocollen. Cellen bleken een normaal karyotype te hebben en produceerden geen teratomen bij immuungecompromitteerde knaagdieren (niet-gepubliceerde gegevens).

Farmacotherapie

Immunosuppressie via ciclosporine A in een dosis van 15 mg/kg/dag werd 10 dagen vóór de operatie gestart en werd daarna een maand voortgezet. Patiënten kregen ook indomethacine 225 mg/dag, beginnend 10 dagen vóór implantatie en gedurende zes maanden postoperatief daarna. Breedspectrumantibioticum (Zannat 700 mg) werd preoperatief en 48 uur postoperatief gegeven. Antiparkinsonmedicatie werd aangepast aan de behoeften van de patiënt.

Stereotactische chirurgie

MRI-geleide stereotactische intraputaminale celimplantatie bij PD-patiënten werd uitgevoerd met behulp van een Leksell Stereotactic System en Stealth Station Surgical Navigation System (Fridley, Minnesota, VS). Ropivacaïne werd gebruikt als plaatselijk verdovingsmiddel voor frameplaatsing. Voor doellocaties werden metingen uitgevoerd met behulp van CT-scanbeelden gefuseerd met eerdere MR-beelden (beide in DICOM-formaat, in axiale secties van 1,0 mm dik). Terwijl de patiënt onder algehele narcose was, werd het stereotactische frame met een Mayfield-hoofdhouder op de operatietafel bevestigd. Bilaterale parasagittale incisies en overeenkomstige boorgaten van 14 mm (één voor elke halve bol) werden gemaakt ter voorbereiding op celsuspensie-injecties. Voor elke zijde werden twee verschillende naaldsporen door hetzelfde boorgat geselecteerd. Doellocaties werden bepaald door de hoogte en lengte van putaminale kernen. De laagste Z-coördinaten van elk spoor bevonden zich in het dorsale putamen en 4 mm uit elkaar in de X-richting. Elk naaldspoor ontving 1 x 106 cellen in 1 cc kweekmedium. Om volledige afgifte van de celsuspensie te garanderen, werden injecties langzaam gedurende 2 minuten uitgevoerd met wederzijdse terugtrekking van de toedieningsnaald om zowel schade aan stamcellen en hersenweefsel te voorkomen, als om reflux of belvorming te voorkomen. Na de operatie werden de patiënten gedurende 1 uur op een conventionele postoperatieve zorgafdeling gehouden. De dag na de operatie werden MR-beelden verkregen om de correcte plaatsing van celsuspensies te bevestigen. Alle patiënten werden 24 uur na de operatie ontslagen.

Neurologische evaluaties

Neurologische eindpunten van deze studie omvatten evaluatie van het aantal en de ernst van bijwerkingen na celtransplantatie, en de werkzaamheid bij de verbetering van motorische reacties, zoals beoordeeld op de UPDRS deel I (mentatie, gedrag en stemming), deel II (motorische activiteiten van het dagelijks leven), deel III (motorische prestaties) en deel IV (complicaties van therapie), evenals de aangepaste schaal van Höehn en Yahr, en de aangepaste Schwab en Engelse activiteiten van de schaal voor dagelijks leven. Patiënten werden klinisch geëvalueerd met deze schalen bij de screening (als basislijn, vóór de operatie) en vervolgens na de procedure na zes en twaalf maanden. Bij elk bezoek werd de patiënten gevraagd om ten minste 12 uur vóór de UPDRS-beoordeling te stoppen met antiparkinsonmedicatie (voor praktische doeleinden werd de "UIT"-status gedefinieerd als het 's nachts stoppen met drugs) om te worden beoordeeld in hun "UIT"-status en vervolgens werd de UPDRS-status beoordeeld. "AAN" medicatie-evaluaties werden uitgevoerd 1 uur na ontvangst van hun gebruikelijke dosis levodopa. Elke patiënt kreeg voor elke beoordeling dezelfde preoperatieve dosis levodopa. Bijwerkingen, waaronder die welke spontaan door de patiënten werden gemeld en die tijdens de evaluaties werden waargenomen, werden geregistreerd. Na het verkrijgen van ondertekende geïnformeerde toestemming van alle patiënten die het onderzoek voltooiden, werden alle "UIT" en "AAN" UPDRS-evaluaties op video opgenomen.

Neuropsychologische evaluaties

Cognitieve prestaties werden geëvalueerd met behulp van de volgende instrumenten: Mexicaanse aanpassingen van Beck en Steer's angst [25] en depressie [26] inventarissen; onze korte neuropsychologische (NEUROPSI)[27,28] en gecomputeriseerde neuropsychologische testbatterijen, en het Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Patiënten rapporteerden over hun kwaliteit van leven in relatie tot hun dagelijkse levensactiviteiten; lichamelijk en geestelijk welzijn (gezondheidstoestand); cognitie en communicatie, en een samenvattende index.

Immunogeniciteit testen

Het bloed van de patiënt werd beoordeeld op toename van titers van hfSC-specifieke antilichamen en op toename van antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit na implantatie in vergelijking met basislijnwaarden. Monsters werden een maand voorafgaand aan de celimplantatie getrokken en vervolgens een maand en zes maanden na de operatie. Van elke patiënt werden volbloedmonsters verzameld en verwerkt als serum één en zes maanden na transplantatie met behulp van de lipofiele membraankleurstof PKH67 (Sigma-Aldrich) zoals beschreven door de fabrikant voor het volgen van cellen in immuunrespons- en cytotoxiciteitstesten door flowcytometrie [30, 31]. Cytotoxiciteitstest werd uitgevoerd met 100:1, 50:1 en 25:1 effector tot doelverhoudingen.

MRI

MR-beelden werden verkregen vóór de operatie (baseline) en drie keer na celimplantatie na 24 uur, en zes en 12 maanden na de operatie. Ze zijn verkregen met een magneet van 3 Tesla, release 2.6.3.8 van MR Systems Achieva Philips (Best, Nederland).

PET moleculaire beeldvorming

Patiënten ondergingen PET-moleculaire beeldvorming bij baseline, na zes maanden (gegevens niet gepresenteerd) en één jaar na hfSC-implantatie. De gebruikte radiofarmaca waren (+)-alfa-[11C]dihidrotetrabenazine (DTBZ), 6-[18F]fluor-L-DOPA (FDOPA) en [11C]Raclopride (RAC). Alle patiënten ondergingen DTBZ-PET-scans en één aanvullend onderzoek met FDOPA of RAC, met een tussenpoos van ten minste een week. Patiënten werd gevraagd om ten minste 12 uur voor elk onderzoek te stoppen met antiparkinsonmedicatie. Scans werden verkregen op een Siemens Biograph 64 PET/CT. Hersenemissiescans van 30 minuten werden verkregen 20 minuten na injectie van DTBZ of RAC, terwijl scans van 15 minuten werden verkregen voor FDOPA 75 minuten na injectie. Alle met FDOPA bestudeerde patiënten kregen premedicatie met 150 mg carbidopa om perifere decarboxylering te voorkomen. Afbeeldingen werden gereconstrueerd met behulp van een OSEM-2D-algoritme en geanalyseerd met de software Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Elk individueel PET-hersenbeeld werd genormaliseerd op een anatomische MRI-atlas om binnen een standaardruimte te worden geëvalueerd. Na normalisatie werden FSL-structurele atlassen gebruikt voor het definiëren van de interessegebieden. Om de kwantitatieve analyse te vergemakkelijken, werden specifieke opnameratio's (SUR) in het caudate en putamen berekend door het achtergrondsignaal van een referentiegebied met niet-specifieke opname af te trekken van striatale activiteit en te delen door activiteit in het referentiegebied [(doelopname - referentieopname)/referentie opname], met behulp van occipitale cortex (DTBZ en FDOPA) en cerebellum (RAC), als referentiegebieden.

statistische analyse

Vergelijkingen tussen basismetingen en follow-upmetingen na 12 maanden voor angst, depressie, NEUROPSI, MMPSE-onderzoeken, tikken met de rechter- en linkervinger in "AAN" en "UIT" medicatiestatussen werden uitgevoerd met behulp van de Wilcoxon-test. Alle andere eindmetingen werden gerapporteerd als individuele resultaten voor elke patiënt.