Parkinsonsche Gehirnreparatur mit menschlichen Stammzellen (HSCfPD)

Diese Studie ist eine longitudinale, prospektive, interventionelle, unkontrollierte Studie, die erstens die Sicherheit und zweitens die potenzielle Wirksamkeit der intraputaminalen Transplantation von undifferenziertem hfSC zur Behandlung von PD testen soll. Die Patienten wurden sorgfältig auf Nebenwirkungen überwacht. Alle Patienten wurden zu Studienbeginn sowie 6 und 12 Monate nach der Operation neurologisch, neuropsychologisch, MRT- und PET-evaluiert.

Die Beschaffung, Isolierung, Expansion und Charakterisierung von hfSC sowie die Bewertung der Immunantwort der Patienten auf die hfSC-Transplantation wurden bei Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA, USA) durchgeführt. Patientenauswahl, neurologische, neuropsychologische und MRT-Bewertungen vor und nach der Operation sowie stereotaktische Chirurgie und postoperative Betreuung wurden im Hospital Angeles del Pedregal (Mexiko-Stadt, Mexiko) durchgeführt. Die Synthese von Radiopharmaka und die PET-Bildgebung wurden in der Radiopharmacy-Cyclotron Unit der Medizinischen Fakultät der Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexiko-Stadt, Mexiko) durchgeführt. Acht Patienten mit mittelschwerer bis fortgeschrittener Parkinson-Erkrankung wurden für diese Studie ausgewählt. Einer der Patienten konnte aus Gründen, die nichts mit dieser Studie zu tun hatten, nicht nachbeobachtet werden. 2 Frauen und 5 Männer im Alter zwischen 43 und 74 Jahren (Durchschnittsalter 56 Jahre) schlossen die Nachbeobachtung ab.

Beschaffung und Ausbau des hfSC

Menschliches fötales Hirngewebe wurde durch routinemäßige sterile manuelle Aspirationsmethoden mit informierter Zustimmung des Spenders gemäß den NIH-Richtlinien für die Verwendung von fötalem Gewebe sowie den Bundes- und Landesgesetzen beschafft. Gewebespender und hfSC-Empfänger blieben einander unbekannt.

Mütterliche Blutproben (Seren) wurden getestet auf: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) Hepatitis A, B und C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter-Agglutinations-Objektträgertest und Reflex-FTA) und Cytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Frauen mit einer Vorgeschichte von Herpes genitalis, Krebs, Asthma, Lupus, rheumatoider Arthritis, Allergien, Vaskulitis autoimmunen Ursprungs und Drogenmissbrauch wurden ausgeschlossen. Die Trächtigkeit wurde nach Carnegie-Stadien bestimmt. Fetales Gewebe wurde in der sechsten Schwangerschaftswoche nach elektiver Abtreibung entnommen. Fötales Gehirn wurde seziert, zerkleinert und zu einer Einzelzellsuspension trituriert. Die Zellen wurden in Kolben kultiviert, die bei 37°C unter hypoxischen Bedingungen (5 % O 2 und 5 % CO 2 ) über 4 Verdopplungen inkubiert wurden. Bei der zweiten Verdopplung (D2) wurde die Zellkultur auf Sterilität getestet (USP <71>) und bei D4 wurde die Kultur karyotypisiert und PCR auf das Vorhandensein zufälliger Erreger getestet: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), Hepatitis A, B und C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Die Zellen wurden dann in ein geschlossenes Bioreaktorsystem (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE) überführt, das unter den gleichen physikalischen und chemischen Bedingungen betrieben wurde. Der Bioreaktor wurde verwendet, um die Master Cell Bank (MCB) zu erstellen, die nach insgesamt sieben Verdopplungen (D7) geerntet, getestet, charakterisiert und geschwindigkeitsgesteuert kryokonserviert wurde.

Nachdem die MCB auf Sicherheit getestet und charakterisiert worden war, wurde ein Teil der Charge aufgetaut und verwendet, um den Bioreaktor für die Produktion der Working Cell Bank (WCB) zu impfen. Die Zellen wurden im Bioreaktor kultiviert, bis sie D13 erreichten. Sie wurden geerntet (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), aliquotiert (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) und kryokonserviert, um ein WCB herzustellen. Das WCB wurde Freigabetests für Sicherheits- und Charakterisierungsassays unterzogen. Die Sicherheitstests umfassten Sterilität (USP <71>), Mykoplasmen (USP <63), Endotoxin (USP <85>) und Karyotypisierung (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Die Charakterisierung beinhaltete durchflusszytometrische Tests für: Okt-4 >90 % (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488-konjugiert), Sox-2 > 90 % (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488-konjugiert), MHC-I < 10 % (A4, eBioscience; APC-konjugiert), MHC-II < 10 % (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488-konjugiert), CD105 <10 % (SN6, eBioscience; PE-Cy7-konjugiert) und Tyrosinhydroxylase <10 % (EP1532Y, Abcam, Cambridge, UK; FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG; Abcam ; polyklonal). Sowohl MCB als auch WCB wurden in Gasphase LN2 bei –196°C gelagert.

Alle Verfahren wurden unter aseptischen Bedingungen in einem ISO 8-Reinraum unter Verwendung von ISO 5-Biosicherheitswerkbänken und Laminar-Airflow-Abzügen gemäß validierten Protokollen durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Zellen einen normalen Karyotyp aufwiesen und bei immungeschwächten Nagetieren keine Teratome produzierten (unveröffentlichte Daten).

Pharmakotherapie

Die Immunsuppression durch Cyclosporin A in einer Dosis von 15 mg/kg/Tag wurde 10 Tage vor der Operation begonnen und danach für einen Monat fortgesetzt. Die Patienten erhielten außerdem Indomethacin 225 mg/Tag, beginnend 10 Tage vor der Implantation und für sechs Monate postoperativ danach. Breitspektrum-Antibiotikum (Zannat 700 mg) wurde präoperativ und 48 Stunden postoperativ verabreicht. Antiparkinson-Medikamente wurden an die Bedürfnisse des Patienten angepasst.

Stereotaktische Chirurgie

MRT-geführte stereotaktische intraputaminale Zellimplantation bei PD-Patienten wurde unter Verwendung eines stereotaktischen Systems von Leksell und eines chirurgischen Navigationssystems Stealth Station (Fridley, Minnesota, USA) durchgeführt. Ropivacain wurde als Lokalanästhetikum für die Rahmenplatzierung verwendet. Für Zielorte wurden Messungen unter Verwendung von CT-Scan-Bildern durchgeführt, die mit früheren MR-Bildern verschmolzen wurden (beide im DICOM-Format, in axialen Schnitten mit einer Dicke von 1,0 mm). Während der Patient unter Vollnarkose stand, wurde der stereotaktische Rahmen mit einem Mayfield-Kopfhalter am Operationstisch befestigt. Bilaterale parasagittale Einschnitte und entsprechende 14-mm-Bohrlöcher (eines für jede Hemisphäre) wurden zur Vorbereitung der Zellsuspensionsinjektionen vorgenommen. Für jede Seite wurden zwei unterschiedliche Nadelbahnen durch das gleiche Gratloch gewählt. Zielorte wurden durch Höhe und Länge der Putaminalkerne bestimmt. Die niedrigsten Z-Koordinaten jeder Spur befanden sich im dorsalen Putamen und waren in X-Richtung 4 mm voneinander beabstandet. Jede Nadelspur erhielt 1 × 10 6 Zellen in 1 ml Kulturmedium. Um eine vollständige Abgabe der Zellsuspension sicherzustellen, wurden die Injektionen langsam für 2 min mit wechselseitigem Zurückziehen der Abgabenadel durchgeführt, um sowohl eine Schädigung der Stammzellen und des Hirngewebes zu vermeiden als auch einen Reflux oder eine Blasenbildung zu verhindern. Nach der Operation wurden die Patienten für 1 h in einer konventionellen postoperativen Pflegestation gehalten. Am Tag nach der Operation wurden MR-Bilder erhalten, um die korrekte Platzierung der Zellsuspensionen zu bestätigen. Alle Patienten wurden 24 h nach der Operation entlassen.

Neurologische Auswertungen

Zu den neurologischen Endpunkten dieser Studie gehörten die Bewertung der Anzahl und Schwere unerwünschter Ereignisse nach der Zelltransplantation und die Wirksamkeit bei der Verbesserung der motorischen Reaktionen, wie anhand des UPDRS Teil I (Mentation, Verhalten und Stimmung), Teil II (motorische Aktivitäten von das tägliche Leben), Teil III (motorische Leistung) und Teil IV (Komplikationen der Therapie), sowie die modifizierte Höehn- und Yahr-Skala und die modifizierte Schwab- und England-Aktivitäten der täglichen Lebensskala. Die Patienten wurden mit diesen Skalen beim Screening (als Baseline, vor der Operation) und dann nach dem Eingriff nach sechs und 12 Monaten klinisch bewertet. Bei jedem Besuch wurden die Patienten gebeten, Antiparkinson-Medikamente mindestens 12 Stunden vor der UPDRS-Beurteilung abzusetzen (für praktische Zwecke wurde der „OFF“-Zustand als nächtlicher Medikamentenentzug definiert), um in ihren „OFF“-Zustand und dann in UPDRS eingestuft zu werden "ON"-Medikationsbewertungen wurden 1 Stunde nach Erhalt ihrer üblichen Levodopa-Dosis durchgeführt. Jeder Patient erhielt für jede Untersuchung die gleiche präoperative Levodopa-Dosis. Unerwünschte Ereignisse, einschließlich derjenigen, die von den Patienten spontan gemeldet wurden, und derjenigen, die während der Auswertungen beobachtet wurden, wurden aufgezeichnet. Nach Erhalt der unterschriebenen Einverständniserklärung aller Patienten, die die Studie abgeschlossen hatten, wurden alle „OFF“- und „ON“-UPDRS-Auswertungen auf Video aufgezeichnet.

Neuropsychologische Auswertungen

Die kognitive Leistung wurde mit den folgenden Instrumenten bewertet: Mexikanische Adaptionen von Beck and Steers Angst- [25] und Depressions-[26] Inventaren; unsere kurzen neuropsychologischen (NEUROPSI)[27,28] und computergestützten neuropsychologischen Testbatterien und die Mini-Mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Die Patienten berichteten über ihre Lebensqualität in Bezug auf ihre täglichen Lebensaktivitäten; körperliches und geistiges Wohlbefinden (Gesundheitszustand); Kognition und Kommunikation sowie ein zusammenfassender Index.

Immunogenitätstests

Das Blut des Patienten wurde auf einen Anstieg der Titer von hfSC-spezifischen Antikörpern und auf einen Anstieg der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität nach der Implantation im Vergleich zu den Ausgangswerten untersucht. Die Proben wurden einen Monat vor der Zellimplantation und dann einen Monat und sechs Monate nach der Operation entnommen. Von jedem Patienten wurden Vollblutproben entnommen und ein und sechs Monate nach der Transplantation unter Verwendung des lipophilen Membranfarbstoffs PKH67 (Sigma-Aldrich) als Serum verarbeitet, wie vom Hersteller für die Zellverfolgung in Immunantwort- und Zytotoxizitätsassays durch Durchflusszytometrie beschrieben [30, 31]. Der Zytotoxizitätsassay wurde mit 100:1, 50:1 und 25:1 Effektor-zu-Target-Verhältnissen durchgeführt.

MRT

MR-Bilder wurden vor der Operation (Basislinie) und dreimal nach der Zellimplantation 24 h sowie sechs und 12 Monate nach der Operation erhalten. Sie wurden mit einem 3-Tesla-Magneten, Version 2.6.3.8 von MR Systems Achieva, erfasst Philips (Best, Niederlande).

Molekulare PET-Bildgebung

Die Patienten wurden zu Studienbeginn, nach sechs Monaten (Daten nicht dargestellt) und ein Jahr nach der hfSC-Implantation einer molekularen PET-Bildgebung unterzogen. Die verwendeten Radiopharmaka waren (+)-alpha-[11C]Dihydrotetrabenazin (DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA (FDOPA) und [11C]Racloprid (RAC). Alle Patienten wurden DTBZ-PET-Scans und einer zusätzlichen Studie mit entweder FDOPA oder RAC im Abstand von mindestens einer Woche unterzogen. Die Patienten wurden gebeten, Antiparkinson-Medikamente mindestens 12 Stunden vor jeder Studie abzusetzen. Die Scans wurden auf einem Siemens Biograph 64 PET/CT aufgenommen. 30-Minuten-Emissionsscans des Gehirns wurden 20 Minuten nach der Injektion von DTBZ oder RAC erfasst, während 15-Minuten-Scans für FDOPA 75 Minuten nach der Injektion erfasst wurden. Alle mit FDOPA untersuchten Patienten wurden mit 150 mg Carbidopa vorbehandelt, um eine periphere Decarboxylierung zu verhindern. Die Bilder wurden mit einem OSEM-2D-Algorithmus rekonstruiert und mit der Software Statistical Parametric Mapping (SPM v.12) analysiert. Jedes einzelne PET-Gehirnbild wurde auf einem anatomischen MRI-Atlas normalisiert, um innerhalb eines Standardraums ausgewertet zu werden. Nach der Normalisierung wurden FSL-Strukturatlanten zur Definition der interessierenden Regionen verwendet. Zur Erleichterung der quantitativen Analyse wurden die spezifischen Aufnahmeverhältnisse (SUR) im Caudat und Putamen berechnet, indem das Hintergrundsignal einer Referenzregion mit unspezifischer Aufnahme von der Striatumaktivität subtrahiert und durch die Aktivität der Referenzregion dividiert wurde [(Zielaufnahme – Referenzaufnahme)/Referenz Aufnahme] unter Verwendung von Okzipitalkortex (DTBZ und FDOPA) und Kleinhirn (RAC) als Referenzregionen.

statistische Analyse

Unter Verwendung des Wilcoxon-Tests wurden Vergleiche zwischen Baseline- und 12-Monats-Follow-up-Messungen für Angstzustände, Depressionen, NEUROPSI, MMPSE-Untersuchungen, Klopfen mit dem rechten und linken Finger in den Medikationszuständen „EIN“ und „AUS“ durchgeführt. Alle anderen Endmessungen wurden als individuelle Ergebnisse für jeden Patienten berichtet.