使用人类干细胞修复帕金森脑 (HSCfPD)

该试验是一项纵向、前瞻性、介入性、非对照研究，旨在首先测试安全性，其次测试未分化 hfSC 的壳内移植治疗 PD 的潜在疗效。 仔细监测患者是否有任何不良反应。 所有患者均接受了基线和术后 6 个月和 12 个月的神经学、神经心理学、MRI 和 PET 评估。

hfSC 的采购、分离、扩展和表征，以及患者对 hfSC 移植的免疫反应评估，均在 Celavie Biosciences, LLC（美国加利福尼亚州奥克斯纳德）进行。 患者选择、术前和术后神经学、神经心理学和 MRI 评估，以及立体定向手术和术后护理均在 Angeles del Pedregal 医院（墨西哥墨西哥城）进行。 放射性药物的合成和 PET 成像是在墨西哥国立自治大学（墨西哥墨西哥城）医学院的放射性药物回旋加速器单元进行的。 该试验选择了 8 名患有中度至晚期 PD 的患者。 由于与本研究无关的原因，其中一名患者失访。 完成随访的受试者为2名女性和5名男性，年龄在43-74岁之间（平均年龄56岁）。

hfSC 的采购和扩展

根据 NIH 胎儿组织使用指南以及联邦和州法律，在捐赠者知情同意的情况下，通过常规无菌手动抽吸方法获取人类胎儿脑组织。 组织捐献者和 hfSC 接受者仍然彼此不认识。

对母体血液样本（血清）进行了以下检测： HTLVI（雅培）； VDRL（百特凝集玻片试验和反射 FTA）和巨细胞病毒（Quest，Oxnard CA）。 有生殖器疱疹、癌症、哮喘、狼疮、类风湿性关节炎、过敏、自身免疫源性血管炎和药物滥用病史的女性被排除在外。 妊娠是根据卡内基分期确定的。 择期流产后，在妊娠第六周采集胎儿组织。 胎儿大脑被解剖、切碎并研磨成单细胞悬液。 细胞在缺氧条件（5% O2 和 5% CO2）下在 37°C 下培养，经过 4 次倍增。 在第二次加倍 (D2) 时，对细胞培养物进行无菌测试 (USP <71>)，在 D4 时，对培养物进行核型分析和 PCR 测试外来因子的存在：HTLV-1、HTLV-2、HIV-1（A、B、 D、F、H、N），甲型、乙型和丙型肝炎，T. p.苍白球、CMV、HSV-1、HSV-2、HPV。 然后将细胞转移到封闭的生物反应器系统（GE WAVE Bioreactor 2/10 System，Uppsala SWE），在相同的物理和化学条件下运行。 生物反应器用于创建主细胞库 (MCB)，在总共七次倍增 (D7) 后对其进行收获、测试、表征和速率控制冷冻保存。

在对 MCB 进行安全测试和表征后，将批次的一部分解冻并用于接种生物反应器以生产工作细胞库 (WCB)。 细胞在生物反应器中培养直至达到 D13。 收集它们（Centritech LAB-III，Carr Centritech Separation System，Rancho Cucamonga，CA，USA），等分（Fill-It；TAP Biosystems，Wilmington，DE，USA），并冷冻保存以创建 WCB。 WCB 接受了安全性和特性分析的放行测试。 安全性测试包括无菌 (USP <71>)、支原体 (USP <63>)、内毒素 (USP <85>) 和核型分析（Cell Line Genetics，美国威斯康星州麦迪逊）。 表征包括流式细胞术测试：Oct-4 >90% (10H11.2, 默克密理博，比尔里卡，马萨诸塞州，美国； AF488 结合），Sox-2 >90%（Btjce，eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥；AF488 结合），MHC-I <10%（A4，eBioscience；APC 结合），MHC-II <10%（CVS20，Novus Biologicals，Littleton CO，美国；AF488 结合），CD105 <10%（SN6，eBioscience；PE-Cy7 结合）和酪氨酸羟化酶 <10%（EP1532Y，Abcam，剑桥，英国；FITC 结合山羊抗兔 IgG；Abcam ; 多克隆）。 MCB 和 WCB 都储存在 -196°C 的气相 LN2 中。

根据经过验证的协议，所有程序均在 ISO 8 洁净室的无菌条件下使用 ISO 5 生物安全柜和层流罩进行。 细胞显示具有正常的核型，并且不会在免疫功能低下的啮齿动物中产生畸胎瘤（未发表的数据）。

药物治疗

在手术前 10 天开始通过环孢菌素 A 以 15 mg/kg/天的剂量进行免疫抑制，并在手术后持续一个月。 患者还接受吲哚美辛 225 毫克/天，从植入前 10 天开始，然后持续六个月。 术前和术后 48 小时给予广谱抗生素（Zannat 700mg）。 根据患者的需要调整抗帕金森病药物。

立体定向手术

使用 Leksell Stereotactic System 和 Stealth Station Surgical Navigation System（Fridley，Minnesota，USA）对 PD 患者进行 MRI 引导的立体定向壳核内细胞植入。 罗哌卡因被用作框架放置的局部麻醉剂。 对于目标位置，使用与先前 MR 图像融合的 CT 扫描图像进行测量（均采用 DICOM 格式，轴向切片厚度为 1.0 毫米）。 患者在全身麻醉下，用 Mayfield 头部支架将立体定向框架固定在手术台上。 为细胞悬液注射做准备时，在双侧矢状旁切口和相应的 14 毫米钻孔（每个半球一个）进行。 为每一侧选择穿过相同钻孔的两个不同的针迹。 目标位置由壳核的高度和长度决定。 每个轨道的最低 Z 坐标位于背壳核，在 X 方向上间隔 4 毫米。 每个针道在 1 cc 培养基中接收 1X106 个细胞。 为确保完整的细胞悬液递送，注射缓慢进行 2 分钟，同时往复抽出递送针，以避免对干细胞和脑组织造成损害，以及避免回流或气泡形成。 手术后，患者被留在传统的术后护理室 1 小时。 手术后的第二天，获得 MR 图像以确认细胞悬浮液的正确放置。 所有患者均于术后 24 h 出院。

神经学评估

本研究的神经学终点包括评估细胞移植后不良事件的数量和严重程度，以及在改善运动反应方面的功效，根据 UPDRS 第 I 部分（精神、行为和情绪）、第 II 部分（运动活动）进行评估日常生活）、第三部分（运动表现）和第四部分（治疗并发症），以及修改后的 Höehn 和 Yahr 量表，以及修改后的 Schwab 和 England 日常生活活动量表。 在筛选时（作为基线，手术前），然后在手术后 6 个月和 12 个月时，使用这些量表对患者进行临床评估。 每次就诊时，要求患者在 UPDRS 评估前至少 12 小时停用抗帕金森病药物（出于实际目的，“OFF”状态定义为隔夜停药），以便在“OFF”状态下进行评级，然后，UPDRS在接受常规剂量的左旋多巴后 1 小时进行“ON”药物评估。 每位患者在每次评估中接受相同的术前左旋多巴剂量。 记录不良事件，包括患者自发报告的不良事件和评估期间观察到的不良事件。 在获得所有完成研究的患者签署的知情同意书后，对所有“OFF”和“ON”UPDRS 评估进行录像。

神经心理学评估

使用以下工具评估认知表现：墨西哥改编的 Beck 和 Steer 焦虑 [25] 和抑郁 [26] 量表；我们的简短神经心理学 (NEUROPSI)[27,28] 和计算机化神经心理学测试组合，以及简易精神帕金森状态检查 (MMPSE)[29]。 患者报告了与日常生活活动相关的生活质量；身心健康（健康状况）；认知和沟通，以及一个总结索引。

免疫原性测试

与基线值相比，评估患者血液植入后 hfSC 特异性抗体滴度的增加和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的增加。 在细胞植入前 1 个月抽取样本，然后在手术后 1 个月和 6 个月抽取样本。 从每位患者收集全血标本，并在移植后 1 个月和 6 个月使用亲脂性膜染料 PKH67（Sigma-Aldrich）处理为血清，如制造商所述，用于免疫反应中的细胞追踪和流式细胞术的细胞毒性测定 [30， 31]。 细胞毒性测定以 100:1、50:1 和 25:1 的效应物与靶标比率进行。

核磁共振

MR 图像是在手术前（基线）和细胞植入后 24 小时、手术后 6 个月和 12 个月获得的 3 次。 他们是用 3 特斯拉磁铁获得的，MR Systems Achieva 版本 2.6.3.8 飞利浦（最佳，荷兰）。

PET分子成像

患者在基线、六个月（数据未提供）和 hfSC 植入后一年接受 PET 分子成像。 使用的放射性药物是 (+)-α-[11C] 二氢四苯嗪 (DTBZ)、6-[18F] 氟-L-多巴 (FDOPA) 和 [11C] 雷氯必利 (RAC)。 所有患者均接受了 DTBZ-PET 扫描和一项额外的 FDOPA 或 RAC 研究，间隔至少一周。 要求患者在每次研究前至少 12 小时停用抗帕金森病药物。 扫描是在 Siemens Biograph 64 PET/CT 上获得的。 在注射 DTBZ 或 RAC 后 20 分钟获得了 30 分钟的脑发射扫描，而在注射后 75 分钟获得了 FDOPA 的 15 分钟扫描。 所有接受 FDOPA 研究的患者都预先服用了 150 mg 卡比多巴，以防止外周脱羧。 使用 OSEM-2D 算法重建图像，并使用软件统计参数映射 (SPM v.12) 进行分析。 每个单独的 PET 大脑图像都在解剖 MRI 图谱上标准化，以便在标准空间内进行评估。 归一化后，FSL 结构图谱用于定义感兴趣的区域。 为了便于定量分析，通过从纹状体活动中减去具有非特异性摄取的参考区域的背景信号并除以参考区域活动 [（目标摄取 - 参考摄取）/参考来计算尾状核和壳核中的特定摄取比（SUR） uptake]，使用枕叶皮层（DTBZ 和 FDOPA）和小脑（RAC）作为参考区域。

统计分析

使用 Wilcoxon 测试对焦虑、抑郁、NEUROPSI、MMPSE 检查、在“开”和“关”药物状态下左右手指敲击的基线和 12 个月随访测量进行比较。 所有其他最终测量报告为每个患者的单独结果。