Восстановление мозга при паркинсонизме с использованием стволовых клеток человека (HSCfPD)

Это исследование представляет собой продольное, проспективное, интервенционное, неконтролируемое исследование, предназначенное для проверки, во-первых, безопасности и, во-вторых, потенциальной эффективности интрапутаминной трансплантации недифференцированных СККЧ для лечения БП. Пациенты находились под тщательным наблюдением на предмет любых побочных эффектов. Всем пациентам проводилось исходное и через 6 и 12 месяцев после операции неврологическое, нейропсихологическое, МРТ и ПЭТ обследование.

Получение, выделение, размножение и характеристика hfSC, а также оценка иммунного ответа пациентов на трансплантацию hfSC были выполнены в компании Celavie Biosciences, LLC (Окснард, Калифорния, США). Отбор пациентов, пред- и послеоперационное неврологическое, нейропсихологическое и МРТ-обследование, а также стереотаксическая хирургия и послеоперационный уход проводились в больнице Анхелес-дель-Педрегал (Мехико, Мексика). Синтез радиофармпрепаратов и ПЭТ-визуализация проводились в отделении радиофармацевтики-циклотрона медицинского факультета Национального автономного университета Мехико (Мехико, Мексика). Для этого исследования были отобраны восемь пациентов с БП от умеренной до тяжелой степени. Один из пациентов был потерян для последующего наблюдения по причинам, не связанным с данным исследованием. Субъектами, завершившими последующее наблюдение, были 2 женщины и 5 мужчин в возрасте от 43 до 74 лет (средний возраст 56 лет).

Закупка и расширение HfSC

Мозговая ткань плода человека была получена с помощью стандартных методов стерильной ручной аспирации с информированного согласия донора в соответствии с рекомендациями NIH по использованию тканей плода, а также федеральными законами и законами штата. Донор тканей и реципиенты hfSC оставались неизвестными друг для друга.

Образцы материнской крови (сыворотки) были исследованы на: ВИЧ (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) гепатиты A, B и C (Abbott); ХТЛВИ (Эбботт); VDRL (тест на предметное стекло агглютинации Бакстера и рефлекс FTA) и цитомегаловирус (Quest, Oxnard CA). Исключались женщины с генитальным герпесом, раком, астмой, волчанкой, ревматоидным артритом, аллергией, васкулитом аутоиммунного генеза, наркоманией. Беременность определяли по стадиям Карнеги. Ткань плода забирали на шестой неделе беременности после планового аборта. Мозг плода вырезали, измельчали ​​и растирали до одноклеточной суспензии. Клетки культивировали в колбах, инкубировали при 37°С в условиях гипоксии (5% О2 и 5% СО2) через 4 удвоения. При втором удвоении (Д2) клеточную культуру тестировали на стерильность (USP <71>), а при Д4 культуру кариотипировали и ПЦР-тестировали на наличие адвентивных агентов: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), гепатиты А, В и С, Т. р. pallidum, ЦМВ, ВПГ-1, ВПГ-2, ВПЧ. Затем клетки переносили в закрытую биореакторную систему (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), работающую в тех же физических и химических условиях. Биореактор использовался для создания основного банка клеток (MCB), который был собран, протестирован, охарактеризован и подвергнут криоконсервации для контроля скорости в общей сложности после семи удвоений (D7).

После того, как MCB был испытан на безопасность и охарактеризован, часть партии была разморожена и использована для затравки биореактора для производства рабочего банка клеток (WCB). Клетки культивировали в биореакторе до тех пор, пока они не достигли D13. Их собирали (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Ранчо Кукамонга, Калифорния, США), разделяли на аликвоты (Fill-It; TAP Biosystems, Уилмингтон, Делавэр, США) и криоконсервировали для создания WCB. WCB был подвергнут испытаниям при выпуске для анализа безопасности и характеристик. Проверка безопасности включала стерильность (USP <71>), микоплазму (USP <63), эндотоксин (USP <85>) и кариотипирование (Cell Line Genetics, Мэдисон, Висконсин, США). Характеристика включала тестирование проточной цитометрией для: Oct-4 >90% (10H11.2, EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс, США; конъюгированный AF488), Sox-2 >90% (Btjce, eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США; конъюгированный AF488), MHC-I <10% (A4, eBioscience; конъюгированный APC), MHC-II <10% (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, США; конъюгированный AF488), CD105 <10% (SN6, eBioscience; конъюгированный PE-Cy7) и тирозингидроксилаза <10% (EP1532Y, Abcam, Кембридж, Великобритания; конъюгированный с FITC козий антикроличий IgG; Abcam ; поликлональный). И МХБ, и РХБ хранили в газовой фазе LN2 при -196°C.

Все процедуры проводились в асептических условиях в чистой комнате ISO 8 с использованием боксов биологической безопасности ISO 5 и вытяжных шкафов с ламинарным потоком воздуха в соответствии с утвержденными протоколами. Было показано, что клетки имеют нормальный кариотип и не продуцируют тератомы у грызунов с ослабленным иммунитетом (неопубликованные данные).

Фармакотерапия

Иммуносупрессию циклоспорином А в дозе 15 мг/кг/сутки начинали за 10 дней до операции и продолжали в течение одного месяца после нее. Пациенты также получали индометацин в дозе 225 мг/сут, начиная с 10 дней до имплантации и в течение шести месяцев после операции. Антибиотик широкого спектра действия (Заннат 700 мг) вводили до операции и через 48 часов после операции. Противопаркинсонические препараты подбирались в соответствии с потребностями пациента.

Стереотаксическая хирургия

Стереотаксическая интрапутаминная имплантация клеток под контролем МРТ пациентам с БП проводилась с использованием стереотаксической системы Leksell и хирургической навигационной системы Stealth Station (Фридли, Миннесота, США). Ропивакаин использовали в качестве местного анестетика при установке каркаса. Для целевых местоположений измерения проводились с использованием изображений КТ, объединенных с предыдущими МР-изображениями (оба в формате DICOM, в аксиальных срезах толщиной 1,0 мм). Под общим наркозом стереотаксическую раму фиксировали к операционному столу головодержателем Mayfield. Двусторонние парасагиттальные разрезы и соответствующие трепанационные отверстия диаметром 14 мм (по одному для каждого полушария) были сделаны при подготовке к инъекциям клеточной суспензии. Для каждой стороны были выбраны два разных следа иглы через одно и то же трепанационное отверстие. Расположение мишеней определяли по высоте и длине ядер скорлупы. Самые низкие Z-координаты каждой дорожки были расположены в дорсальной скорлупе и отстояли друг от друга на 4 мм в направлении X. На каждую игольчатую дорожку вводили 1×106 клеток в 1 см3 культуральной среды. Для обеспечения полной доставки клеточной суспензии инъекции проводили медленно в течение 2 мин с реципрокным извлечением иглы для доставки, чтобы избежать как повреждения стволовых клеток и ткани головного мозга, так и предотвращения рефлюкса или образования пузырей. После операции пациенты в течение 1 часа находились в обычном послеоперационном отделении. На следующий день после операции были получены МРТ-изображения для подтверждения правильного размещения клеточных суспензий. Все пациенты были выписаны через 24 ч после операции.

Неврологические оценки

Неврологические конечные точки этого исследования включали оценку количества и тяжести нежелательных явлений после трансплантации клеток, а также эффективность в улучшении двигательных реакций по шкале UPDRS, часть I (мышление, поведение и настроение), часть II (двигательная активность повседневной жизни), часть III (двигательная активность) и часть IV (осложнения терапии), а также модифицированную шкалу Хёна и Яра и модифицированную шкалу активности Шваба и Ингланда шкалы повседневной жизни. Пациенты были клинически оценены с помощью этих шкал при скрининге (исходно, перед операцией), а затем после процедуры через шесть и 12 месяцев. При каждом посещении пациентов просили прекратить прием противопаркинсонических препаратов по крайней мере за 12 часов до оценки UPDRS (для практических целей состояние «ВЫКЛЮЧЕНО» определялось как отмена препарата в течение ночи), чтобы оценить их состояние «ВЫКЛЮЧЕНО», а затем UPDRS. Оценку лекарств «ON» проводили через 1 час после получения их обычной дозы леводопы. Каждый пациент получал одинаковую предоперационную дозу леводопы для каждой оценки. Были зарегистрированы нежелательные явления, в том числе те, о которых сообщали пациенты спонтанно, и те, которые наблюдались во время оценок. После получения подписанного информированного согласия от всех пациентов, завершивших исследование, все оценки UPDRS «ВЫКЛ» и «ВКЛ» были записаны на видеопленку.

Нейропсихологические оценки

Когнитивные способности оценивались с использованием следующих инструментов: мексиканская адаптация опросников Бека и Стира по тревоге [25] и депрессии [26]; наши краткие нейропсихологические (NEUROPSI) [27,28] и компьютеризированные батареи нейропсихологических тестов, а также Мини-психическое обследование состояния Паркинсона (MMPSE) [29]. Пациенты сообщали о качестве своей жизни в связи с их повседневной деятельностью; физическое и психическое благополучие (состояние здоровья); познание и общение, а также один сводный указатель.

Тестирование иммуногенности

В крови пациентов оценивали повышение титров специфических антител к СККЧ и повышение антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности после имплантации по сравнению с исходными значениями. Образцы были взяты за один месяц до имплантации клеток, а затем через один месяц и шесть месяцев после операции. Образцы цельной крови были собраны у каждого пациента и обработаны как сыворотка через один и шесть месяцев после трансплантации с использованием липофильного мембранного красителя PKH67 (Sigma-Aldrich), как описано производителем для отслеживания клеток в иммунном ответе и анализах цитотоксичности с помощью проточной цитометрии [30, 31]. Анализ цитотоксичности проводили при соотношении эффектора к мишени 100:1, 50:1 и 25:1.

МРТ

МРТ-изображения были получены до операции (исходный уровень) и трижды после имплантации клеток через 24 часа, а также через шесть и 12 месяцев после операции. Они были приобретены с помощью магнита 3 Тесла, выпуск MR Systems Achieva 2.6.3.8. Philips (Лучший, Нидерланды).

молекулярная визуализация ПЭТ

Пациентам выполняли молекулярную визуализацию ПЭТ исходно, через шесть месяцев (данные не представлены) и через год после имплантации hfSC. Используемые радиофармацевтические препараты представляли собой (+)-альфа-[11C]дигидротетрабеназин (DTBZ), 6-[18F]фтор-L-ДОФА (FDOPA) и [11C]раклоприд (RAC). Все пациенты прошли сканирование DTBZ-PET и одно дополнительное исследование либо с FDOPA, либо с RAC с интервалом не менее одной недели. Пациентов просили прекратить прием противопаркинсонических препаратов по крайней мере за 12 часов до каждого исследования. Сканы были получены на Siemens Biograph 64 PET/CT. Тридцатиминутное сканирование эмиссии мозга было получено через 20 минут после инъекции DTBZ или RAC, а 15-минутное сканирование было получено для FDOPA через 75 минут после инъекции. Все пациенты, участвовавшие в исследовании с ФДОФА, предварительно получали 150 мг карбидопы для предотвращения периферического декарбоксилирования. Изображения были реконструированы с использованием алгоритма OSEM-2D и проанализированы с помощью программного обеспечения Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Каждое отдельное ПЭТ-изображение мозга было нормализовано по анатомическому атласу МРТ для оценки в стандартном пространстве. После нормализации структурные атласы FSL использовались для определения областей интереса. Для облегчения количественного анализа коэффициенты специфического поглощения (SUR) в хвостатом и скорлупе рассчитывали путем вычитания фонового сигнала эталонной области с неспецифическим поглощением из полосатой активности и деления на активность эталонной области [(целевое поглощение - эталонное поглощение)/эталонное поглощение], используя затылочную кору (DTBZ и FDOPA) и мозжечок (RAC) в качестве эталонных областей.

статистический анализ

Сравнения между исходными и 12-месячными последующими измерениями тревоги, депрессии, обследований NEUROPSI, MMPSE, постукивания пальцами правой и левой руки в состояниях «ВКЛ» и «ВЫКЛ» были выполнены с использованием теста Уилкоксона. Все другие конечные показатели сообщались как индивидуальные результаты для каждого пациента.