Parkinsonisk hjernereparasjon ved hjelp av menneskelige stamceller (HSCfPD)

Denne studien er en longitudinell, prospektiv, intervensjonell, ukontrollert studie designet for å teste for det første sikkerheten og for det andre den potensielle effekten av intraputaminal poding av udifferensiert hfSC for behandling av PD. Pasientene ble overvåket nøye for eventuelle bivirkninger. Alle pasientene gjennomgikk baseline og 6- og 12-måneders post-kirurgiske nevrologiske, nevropsykologiske, MR- og PET-evalueringer.

Anskaffelse, isolering, utvidelse og karakterisering av hfSC, samt vurdering av pasientenes immunrespons på hfSC-transplantasjon, ble utført ved Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA USA). Pasientutvelgelse, nevrologiske, nevropsykologiske og MR-evalueringer før og etter kirurgi, samt stereotaktisk kirurgi og behandling etter kirurgi, ble utført ved Hospital Angeles del Pedregal (Mexico City, Mexico). Syntese av radiofarmasøytika og PET-avbildning ble utført ved Radiopharmacy-Cyclotron Unit ved Det medisinske fakultet, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexico City, Mexico). Åtte pasienter med moderat til avansert PD ble valgt ut for denne studien. En av pasientene gikk tapt for å følge opp på grunn av årsaker som ikke var relatert til denne studien. Forsøkspersonene som fullførte oppfølgingen var 2 kvinner og 5 menn, med alderen 43-74 år (gjennomsnittsalder 56 år).

Anskaffelse og utvidelse av hfSC

Menneskelig føtalt hjernevev ble fremskaffet via rutinemessige sterile manuelle aspirasjonsmetoder med informert samtykke fra giveren i samsvar med NIHs retningslinjer for bruk av føtalt vev samt føderale og statlige lover. Vevsdonor og hfSC-mottakere forble ukjente for hverandre.

Mors blodprøver (sera) ble testet for: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) hepatitt A, B og C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test and reflex FTA), og cytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Kvinner med en historie med genital herpes, kreft, astma, lupus, revmatoid artritt, allergier, vaskulitt av autoimmun opprinnelse og narkotikamisbruk ble ekskludert. Svangerskapet ble bestemt i henhold til Carnegie-stadier. Fostervev ble høstet ved sjette svangerskapsuke etter elektiv abort. Fosterhjerne ble dissekert, hakket og triturert til en enkeltcellesuspensjon. Celler ble dyrket i kolber inkubert ved 37°C under hypoksiske forhold (5 % O2 og 5 % CO2) gjennom 4 doblinger. Ved den andre doblingen (D2) ble cellekultur testet for sterilitet (USP <71>) og ved D4 ble kulturen karyotypet og PCR testet for tilstedeværelse av tilfeldige stoffer: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatitt A, B og C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Celler ble deretter overført til et lukket bioreaktorsystem (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), som opererer under de samme fysiske og kjemiske forholdene. Bioreaktoren ble brukt til å lage Master Cell Bank (MCB), som ble høstet, testet, karakterisert og hastighetskontroll kryokonservert etter totalt syv doblinger (D7).

Etter at MCB var sikkerhetstestet og karakterisert, ble en del av batchen tint og brukt til å så bioreaktoren for produksjonen av Working Cell Bank (WCB). Celler ble dyrket i bioreaktoren til de nådde D13. De ble høstet (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), alikvotert (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA), og kryokonservert for å lage en WCB. WCB ble utsatt for utgivelsestesting for sikkerhets- og karakteriseringsanalyser. Sikkerhetstesting inkluderte sterilitet (USP <71>), mykoplasma (USP <63), endotoksin (USP <85>) og karyotyping (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Karakterisering inkluderte flowcytometritesting for: okt-4 >90 % (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488-konjugert), Sox-2 >90 % (Btjce, eBioscience, San Diego, CA, USA; AF488-konjugert), MHC-I <10 % (A4, eBioscience; APC-konjugert), MHC-II <10 % (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488-konjugert), CD105 <10 % (SN6, eBioscience; PE-Cy7-konjugert) og tyrosinhydroksylase <10 % (EP1532Y, Abcam, Cambridge, Storbritannia; FITC-konjugert geit-anti-kanin IgG; Abcam ; polyklonal). Både MCB og WCB ble lagret i gassfase LN2 ved -196°C.

Alle prosedyrer ble utført under aseptiske forhold i et ISO 8-renrom, ved bruk av ISO 5 biosikkerhetsskap og laminære luftstrømhetter, i henhold til validerte protokoller. Celler ble vist å ha en normal karyotype og produserte ikke teratomer hos immunkompromitterte gnagere (upubliserte data).

Farmakoterapi

Immunsuppresjon via ciklosporin A ved en dose på 15 mg/kg/dag ble startet 10 dager før operasjonen og fortsatte i en måned deretter. Pasientene fikk også indometacin 225 mg/dag, fra 10 dager før implantasjon og i seks måneder postoperativt deretter. Bredspektret antibiotika (Zannat 700 mg) ble gitt preoperativt og 48 timer postoperativt. Antiparkinsonmedisiner ble justert til pasientens behov.

Stereotaktisk kirurgi

MR-veiledet stereotaktisk intraputaminal celleimplantasjon i PD-pasienter ble utført ved bruk av et Leksell Stereotactic System og Stealth Station Surgical Navigation System (Fridley, Minnesota, USA). Ropivacaine ble brukt som lokalbedøvelse for rammeplassering. For målplasseringer ble målinger utført ved bruk av CT-skanningsbilder smeltet sammen med tidligere MR-bilder (begge i DICOM-format, i aksiale snitt 1,0 mm tykke). Med pasienten under generell anestesi ble den stereotaktiske rammen festet til operasjonsbordet med en Mayfield-hodeholder. Bilaterale parasagittale snitt og tilsvarende 14 mm borehull (ett for hver halvkule) ble laget som forberedelse til cellesuspensjonsinjeksjoner. To forskjellige nålespor gjennom samme borehull ble valgt for hver side. Målplasseringer ble bestemt av høyde og lengde på putaminalkjerner. De laveste Z-koordinatene til hvert spor var plassert i dorsal putamen og plassert 4 mm fra hverandre i X-retningen. Hvert nålespor mottok 1X106 celler i 1 cc kulturmedium. For å sikre fullstendig levering av cellesuspensjon, ble injeksjoner utført sakte i 2 minutter med gjensidig tilbaketrekking av leveringsnålen for å unngå både skade på stamceller og hjernevev, samt for å unngå refluks eller bobledannelse. Etter operasjonen ble pasientene holdt i en konvensjonell postoperativ behandlingsenhet i 1 time. Dagen etter operasjonen ble det tatt MR-bilder for å bekrefte korrekt plassering av cellesuspensjoner. Alle pasienter ble utskrevet 24 timer etter operasjonen.

Nevrologiske evalueringer

Nevrologiske endepunkter for denne studien inkluderte evaluering av antall og alvorlighetsgrad av uønskede hendelser etter celletransplantasjon, og effektiviteten i forbedring av motoriske responser, som vurdert på UPDRS del I (mentasjon, atferd og humør), del II (motoriske aktiviteter av det daglige livet), del III (motorisk ytelse) og del IV (komplikasjoner ved terapi), samt den modifiserte Höehn og Yahr-skalaen, og den modifiserte Schwab og England Activities of the Daily Living Scale. Pasientene ble klinisk evaluert med disse skalaene ved screening (som baseline, før operasjonen), og deretter etter prosedyren ved seks og 12 måneder. Ved hvert besøk ble pasientene bedt om å seponere antiparkinsonmedisiner minst 12 timer før UPDRS-vurderingen (for praktiske formål ble "AV"-tilstand definert som medisinavvenning over natten) for å bli vurdert i "AV"-tilstand og deretter UPDRS "ON" medisinevalueringer ble utført 1 time etter å ha mottatt sin vanlige dose levodopa. Hver pasient fikk den samme preoperative levodopadosen for hver vurdering. Bivirkninger, inkludert de som ble rapportert av pasientene spontant og de som ble observert under evalueringene, ble registrert. Etter å ha innhentet signert informert samtykke fra alle pasienter som fullførte studien, ble alle "AV" og "PÅ" UPDRS-evalueringer filmet.

Nevropsykologiske evalueringer

Kognitiv ytelse ble evaluert ved hjelp av følgende instrumenter: Meksikanske tilpasninger av Beck og Steers angst [25] og depresjon [26] inventar; våre korte nevropsykologiske (NEUROPSI)[27,28] og datastyrte nevropsykologiske testbatterier, og Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Pasienter rapporterte om deres livskvalitet relatert til deres daglige aktiviteter; fysisk og mentalt velvære (helsestatus); kognisjon og kommunikasjon, og en oppsummerende indeks.

Immunogenisitetstesting

Pasientens blod ble evaluert for økning i titere av hfSC-spesifikke antistoffer og for økning i antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet etter implantasjon sammenlignet med baseline-verdier. Prøver ble tatt en måned før celleimplantasjon, og deretter en måned og seks måneder etter operasjonen. Fullblodsprøver ble tatt fra hver pasient og behandlet som serum én og seks måneder etter poding ved bruk av det lipofile membranfargestoffet PKH67 (Sigma-Aldrich) som beskrevet av produsenten for cellesporing i immunrespons- og cytotoksisitetsanalyser ved flowcytometri [30, 31]. Cytotoksisitetsanalyse ble utført med 100:1, 50:1 og 25:1 effektor-til-mål-forhold.

MR

MR-bilder ble tatt før operasjonen (grunnlinje) og tre ganger etter celleimplantasjon 24 timer og seks og 12 måneder etter operasjonen. De ble anskaffet med en 3 Tesla-magnet, MR Systems Achieva utgivelse 2.6.3.8 Philips (Best, Nederland).

PET molekylær avbildning

Pasientene gjennomgikk PET-molekylær avbildning ved baseline, seks måneder (data ikke presentert) og ett år etter hfSC-implantasjon. Radiofarmasøytiske midler som ble brukt var (+)-alfa-[11C]Dihidrotetrabenazin (DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA (FDOPA) og [11C]Raclopride (RAC). Alle pasientene gjennomgikk DTBZ-PET-skanninger og én tilleggsstudie med enten FDOPA eller RAC, med minst én ukes mellomrom. Pasientene ble bedt om å seponere antiparkinsonmedisiner minst 12 timer før hver studie. Skanninger ble innhentet på en Siemens Biograph 64 PET/CT. 30-minutters hjerneemisjonsskanninger ble innhentet 20 minutter etter injeksjon av DTBZ eller RAC, mens 15-minutters skanninger ble innhentet for FDOPA 75 minutter etter injeksjon. Alle pasienter som ble studert med FDOPA ble premedisinert med 150 mg karbidopa for å forhindre perifer dekarboksylering. Bilder ble rekonstruert ved hjelp av en OSEM-2D-algoritme og analysert med programvaren Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Hvert enkelt PET-hjernebilde ble normalisert på et anatomisk MR-atlas for å bli evaluert innenfor et standardrom. Etter normalisering ble FSL strukturelle atlas brukt for definisjon av regionene av interesse. For å lette den kvantitative analysen ble spesifikke opptaksforhold (SUR) i caudat og putamen beregnet ved å trekke fra bakgrunnssignalet til en referanseregion med uspesifikk opptak fra striatal aktivitet og dividere med referanseregionaktivitet [(målopptak - referanseopptak)/referanse opptak], ved bruk av occipital cortex (DTBZ og FDOPA) og cerebellum (RAC), som referanseregioner.

Statistisk analyse

Sammenligninger mellom baseline- og 12-måneders oppfølgingsmålinger for angst, depresjon, NEUROPSI, MMPSE-undersøkelser, banking av høyre og venstre finger i "ON" og "OFF" medisineringstilstander ble utført ved bruk av Wilcoxon-testen. Alle andre sluttmål ble rapportert som individuelle resultater for hver pasient.