Riparazione del cervello parkinsoniano utilizzando cellule staminali umane (HSCfPD)

Questo studio è uno studio longitudinale, prospettico, interventistico e non controllato progettato per testare, in primo luogo, la sicurezza e, in secondo luogo, la potenziale efficacia dell'innesto intraputaminale di hfSC indifferenziato per il trattamento del PD. I pazienti sono stati monitorati attentamente per eventuali effetti avversi. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a valutazioni neurologiche, neuropsicologiche, MRI e PET al basale ea 6 e 12 mesi dopo l'intervento chirurgico.

L'approvvigionamento, l'isolamento, l'espansione e la caratterizzazione di hfSC, nonché la valutazione della risposta immunitaria dei pazienti all'innesto di hfSC, sono stati eseguiti presso Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA USA). La selezione dei pazienti, le valutazioni neurologiche, neuropsicologiche e MRI pre e post-operatorie, nonché la chirurgia stereotassica e le cure post-operatorie, sono state eseguite presso l'Hospital Angeles del Pedregal (Città del Messico, Messico). La sintesi di radiofarmaci e l'imaging PET sono state effettuate presso l'Unità di radiofarmacia-ciclotrone della Facoltà di Medicina, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Città del Messico, Messico). Otto pazienti con PD da moderato a avanzato sono stati selezionati per questo studio. Uno dei pazienti è stato perso al follow-up per motivi estranei a questo studio. I soggetti che hanno completato il follow-up erano 2 femmine e 5 maschi, di età compresa tra 43 e 74 anni (età media 56 anni).

Approvvigionamento ed espansione di hfSC

Il tessuto cerebrale fetale umano è stato prelevato tramite metodi di aspirazione manuale sterili di routine con il consenso informato del donatore in conformità con le linee guida NIH per l'uso del tessuto fetale, nonché con le leggi federali e statali. I donatori di tessuti e i destinatari di hfSC sono rimasti sconosciuti l'uno all'altro.

I campioni di sangue materno (sieri) sono stati testati per: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) epatite A, B e C (Abbott); HTLVI (Abate); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test e reflex FTA) e citomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Sono state escluse le donne con una storia di herpes genitale, cancro, asma, lupus, artrite reumatoide, allergie, vasculite di origine autoimmune e abuso di droghe. La gestazione è stata determinata secondo le fasi Carnegie. Il tessuto fetale è stato raccolto alla sesta settimana di gestazione dopo l'aborto elettivo. Il cervello fetale è stato sezionato, tritato e triturato in una singola sospensione cellulare. Le cellule sono state coltivate in fiasche incubate a 37°C in condizioni ipossiche (5% O2 e 5% CO2) attraverso 4 raddoppiamenti. Al secondo raddoppio (D2) la coltura cellulare è stata testata per la sterilità (USP <71>) e al D4 la coltura è stata cariotipizzata e la PCR testata per la presenza di agenti avventizi: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), epatite A, B e C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Le cellule sono state quindi trasferite in un sistema bioreattore chiuso (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), operante nelle stesse condizioni fisiche e chimiche. Il bioreattore è stato utilizzato per creare la Master Cell Bank (MCB), che è stata raccolta, testata, caratterizzata e crioconservata con controllo della velocità dopo un totale di sette raddoppi (D7).

Dopo che l'MCB è stato testato e caratterizzato per la sicurezza, una parte del lotto è stata scongelata e utilizzata per seminare il bioreattore per la produzione di Working Cell Bank (WCB). Le cellule sono state coltivate nel bioreattore fino a raggiungere D13. Sono stati raccolti (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), aliquotati (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) e criopreservati per creare un WCB. Il WCB è stato sottoposto a test di rilascio per test di sicurezza e caratterizzazione. I test di sicurezza includevano sterilità (USP <71>), micoplasma (USP <63), endotossina (USP <85>) e cariotipo (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). La caratterizzazione includeva test di citometria a flusso per: Oct-4 >90% (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488 coniugato), Sox-2 >90% (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488 coniugato), MHC-I <10% (A4, eBioscience; APC coniugato), MHC-II <10% (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488 coniugato), CD105 <10% (SN6, eBioscience; PE-Cy7 coniugato) e tirosina idrossilasi <10% (EP1532Y, Abcam, Cambridge, UK; FITC coniugato IgG anti-coniglio di capra; Abcam ; policlonale). Sia MCB che WCB sono stati conservati in fase gassosa LN2 a -196°C.

Tutte le procedure sono state eseguite in condizioni asettiche in una camera bianca ISO 8, utilizzando cappe di biosicurezza ISO 5 e cappe a flusso d'aria laminare, secondo protocolli convalidati. È stato dimostrato che le cellule avevano un cariotipo normale e non producevano teratomi nei roditori immunocompromessi (dati non pubblicati).

Farmacoterapia

L'immunosoppressione tramite ciclosporina A alla dose di 15 mg/kg/giorno è stata iniziata 10 giorni prima dell'intervento e continuata per un mese successivo. I pazienti hanno anche ricevuto indometacina 225 mg/giorno, a partire da 10 giorni prima dell'impianto e per sei mesi dopo l'intervento. Antibiotico ad ampio spettro (Zannat 700 mg) è stato somministrato prima dell'intervento e 48 ore dopo l'intervento. I farmaci antiparkinson sono stati adattati alle esigenze del paziente.

Chirurgia stereotassica

L'impianto di cellule intraputaminali stereotassiche guidato dalla risonanza magnetica in pazienti con PD è stato eseguito utilizzando un sistema stereotassico Leksell e un sistema di navigazione chirurgica Stealth Station (Fridley, Minnesota, USA). La ropivacaina è stata utilizzata come anestetico locale per il posizionamento del telaio. Per le posizioni dei target, le misurazioni sono state effettuate utilizzando immagini TAC fuse con precedenti immagini RM (entrambe in formato DICOM, in sezioni assiali spesse 1,0 mm). Con il paziente in anestesia generale, il telaio stereotassico è stato fissato al tavolo operatorio con un poggiatesta Mayfield. Incisioni parasagittali bilaterali e corrispondenti fori di bava da 14 mm (uno per ciascun emisfero) sono stati realizzati in preparazione per le iniezioni di sospensione cellulare. Per ogni lato sono state selezionate due diverse tracce dell'ago attraverso lo stesso foro della bava. Le posizioni dei bersagli sono state determinate dall'altezza e dalla lunghezza dei nuclei putaminali. Le coordinate Z più basse di ciascuna traccia erano situate nel putamen dorsale e distanziate di 4 mm nella direzione X. Ciascuna traccia dell'ago ha ricevuto 1X106 cellule in 1 cc di terreno di coltura. Per garantire l'erogazione completa della sospensione cellulare, le iniezioni sono state effettuate lentamente per 2 minuti con ritiro reciproco dell'ago di erogazione per evitare sia danni alle cellule staminali e al tessuto cerebrale, sia per evitare il reflusso o la formazione di bolle. Dopo l'intervento chirurgico, i pazienti sono stati tenuti in un'unità di cura postoperatoria convenzionale per 1 ora. Il giorno successivo all'intervento, sono state ottenute immagini RM per confermare il corretto posizionamento delle sospensioni cellulari. Tutti i pazienti sono stati dimessi 24 ore dopo l'intervento.

Valutazioni neurologiche

Gli endpoint neurologici di questo studio includevano la valutazione del numero e della gravità degli eventi avversi dopo l'innesto di cellule e l'efficacia nel miglioramento delle risposte motorie, come valutato sulla UPDRS parte I (mente, comportamento e umore), parte II (attività motorie di la vita quotidiana), parte III (prestazioni motorie) e parte IV (complicanze della terapia), nonché la scala Höehn e Yahr modificata e la scala Schwab e England modificata della scala della vita quotidiana. I pazienti sono stati valutati clinicamente con queste scale allo screening (come baseline, prima dell'intervento chirurgico) e poi dopo la procedura a sei e 12 mesi. Ad ogni visita, ai pazienti veniva chiesto di interrompere i farmaci antiparkinsoniani almeno 12 ore prima della valutazione UPDRS (per scopi pratici, lo stato "OFF" era definito come sospensione notturna del farmaco) per essere valutati nel loro stato "OFF" e quindi, UPDRS Le valutazioni del farmaco "ON" sono state eseguite 1 ora dopo aver ricevuto la dose abituale di levodopa. Ogni paziente ha ricevuto la stessa dose di levodopa preoperatoria per ogni valutazione. Sono stati registrati gli eventi avversi, compresi quelli segnalati spontaneamente dai pazienti e quelli osservati durante le valutazioni. Dopo aver ottenuto il consenso informato firmato da tutti i pazienti che hanno completato lo studio, tutte le valutazioni UPDRS "OFF" e "ON" sono state videoregistrate.

Valutazioni neuropsicologiche

Le prestazioni cognitive sono state valutate utilizzando i seguenti strumenti: adattamenti messicani degli inventari di ansia di Beck e Steer [25] e depressione [26]; le nostre batterie di test neuropsicologici brevi (NEUROPSI)[27,28] e neuropsicologici computerizzati e il Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. I pazienti hanno riferito della loro qualità di vita in relazione alle loro attività quotidiane; benessere fisico e mentale (stato di salute); cognizione e comunicazione e un indice riassuntivo.

Test di immunogenicità

Il sangue del paziente è stato valutato per l'aumento dei titoli di anticorpi specifici per hfSC e per l'aumento della citotossicità cellulo-mediata dipendente dall'anticorpo dopo l'impianto rispetto ai valori basali. I campioni sono stati prelevati un mese prima dell'impianto cellulare e poi un mese e sei mesi dopo l'intervento chirurgico. Campioni di sangue intero sono stati raccolti da ciascun paziente e processati come siero uno e sei mesi dopo l'innesto utilizzando il colorante lipofilo della membrana PKH67 (Sigma-Aldrich) come descritto dal produttore per il monitoraggio delle cellule nella risposta immunitaria e nei test di citotossicità mediante citometria a flusso [30, 31]. Il test di citotossicità è stato eseguito con rapporti effettori/target 100:1, 50:1 e 25:1.

risonanza magnetica

Le immagini MR sono state ottenute prima dell'intervento chirurgico (linea di base) e tre volte dopo l'impianto cellulare a 24 ore e sei e 12 mesi dopo l'intervento. Sono stati acquisiti con un magnete da 3 Tesla, MR Systems Achieva versione 2.6.3.8 Philips (Migliore, Paesi Bassi).

Imaging molecolare PET

I pazienti sono stati sottoposti a imaging molecolare PET al basale, a sei mesi (dati non presentati) ea un anno dopo l'impianto di hfSC. I radiofarmaci utilizzati erano (+)-alfa-[11C]Dihidrotetrabenazina (DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA (FDOPA) e [11C]Raclopride (RAC). Tutti i pazienti sono stati sottoposti a scansioni DTBZ-PET e a uno studio aggiuntivo con FDOPA o RAC, a distanza di almeno una settimana. Ai pazienti è stato chiesto di interrompere i farmaci antiparkinsoniani almeno 12 ore prima di ogni studio. Le scansioni sono state acquisite su un Siemens Biograph 64 PET/CT. Le scansioni delle emissioni cerebrali di trenta minuti sono state acquisite 20 minuti dopo l'iniezione di DTBZ o RAC, mentre le scansioni di 15 minuti sono state acquisite per FDOPA 75 minuti dopo l'iniezione. Tutti i pazienti studiati con FDOPA sono stati premedicati con 150 mg di carbidopa per prevenire la decarbossilazione periferica. Le immagini sono state ricostruite utilizzando un algoritmo OSEM-2D e analizzate con il software Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Ogni singola immagine cerebrale PET è stata normalizzata su un atlante MRI anatomico per essere valutata all'interno di uno spazio standard. Dopo la normalizzazione, sono stati utilizzati atlanti strutturali FSL per la definizione delle regioni di interesse. Per facilitare l'analisi quantitativa, sono stati calcolati i rapporti di assorbimento specifico (SUR) nel caudato e nel putamen sottraendo il segnale di fondo di una regione di riferimento con assorbimento non specifico dall'attività striatale e dividendo per l'attività della regione di riferimento [(assorbimento target - assorbimento di riferimento)/riferimento captazione], utilizzando la corteccia occipitale (DTBZ e FDOPA) e il cervelletto (RAC), come regioni di riferimento.

analisi statistica

I confronti tra le misurazioni al basale e al follow-up di 12 mesi per ansia, depressione, NEUROPSI, esami MMPSE, picchiettio del dito destro e sinistro negli stati di trattamento "ON" e "OFF" sono stati eseguiti utilizzando il test di Wilcoxon. Tutte le altre misure finali sono state riportate come risultati individuali per ciascun paziente.