Parkinsonin taudin aivojen korjaaminen ihmisen kantasoluilla (HSCfPD)

Tämä tutkimus on pitkittäinen, prospektiivinen, interventio, kontrolloimaton tutkimus, jonka tarkoituksena on testata ensinnäkin erilaistumattoman hfSC:n intraputaminaalisen siirron turvallisuutta ja toiseksi mahdollista tehoa PD:n hoidossa. Potilaita seurattiin huolellisesti mahdollisten haittavaikutusten varalta. Kaikille potilaille tehtiin neurologiset, neuropsykologiset, MRI- ja PET-arvioinnit lähtötilanteessa ja 6 ja 12 kuukauden kuluttua leikkauksesta.

hfSC:n hankinta, eristäminen, laajentaminen ja karakterisointi sekä potilaiden immuunivasteen arviointi hfSC-siirteelle suoritettiin Celavie Biosciences, LLC:ssä (Oxnard, CA USA). Potilaiden valinta, ennen leikkausta ja sen jälkeen neurologiset, neuropsykologiset ja MRI-arvioinnit sekä stereotaktinen leikkaus ja leikkauksen jälkeinen hoito suoritettiin sairaalassa Angeles del Pedregal (México, Meksiko). Radiofarmaseuttisten aineiden synteesi ja PET-kuvaus suoritettiin lääketieteellisen tiedekunnan radiofarmasian-syklotroniyksikössä, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (México, Meksiko). Tähän tutkimukseen valittiin kahdeksan potilasta, joilla oli kohtalainen tai pitkälle edennyt PD. Yksi potilaista jäi seurantaan syistä, jotka eivät liity tähän tutkimukseen. Koehenkilöt, jotka suorittivat seurannan, olivat 2 naista ja 5 miestä, joiden ikä vaihteli välillä 43-74 vuotta (keski-ikä 56 vuotta).

hfSC:n hankinta ja laajentaminen

Ihmisen sikiön aivokudos hankittiin rutiininomaisilla steriileillä manuaalisilla aspiraatiomenetelmillä luovuttajan tietoisella suostumuksella NIH:n sikiökudoksen käyttöä koskevien ohjeiden sekä liittovaltion ja osavaltion lakien mukaisesti. Kudosluovuttajat ja hfSC-vastaanottajat jäivät toisilleen tuntemattomiksi.

Äidin verinäytteet (seerumit) testattiin: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) hepatiitti A, B ja C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test and Reflex FTA) ja sytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Naiset, joilla on ollut sukuelinten herpes, syöpä, astma, lupus, nivelreuma, allergiat, autoimmuuniperäinen vaskuliitti ja huumeiden väärinkäyttö, suljettiin pois. Raskaus määritettiin Carnegie-vaiheiden mukaan. Sikiökudos otettiin talteen kuudennella raskausviikolla elektiivisen abortin jälkeen. Sikiön aivot leikattiin, jauhettiin ja trituroitiin yksisolususpensioksi. Soluja viljeltiin pulloissa, joita inkuboitiin 37 °C:ssa hypoksisissa olosuhteissa (5 % 02 ja 5 % C02) neljään kaksinkertaistumiseen. Toisessa kaksinkertaistumisessa (D2) soluviljelmän steriiliys testattiin (USP <71>) ja D4:ssä viljelmä karyotyypitettiin ja PCR testattiin satunnaisten tekijöiden: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatiitti A, B ja C, T. s. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Sitten solut siirrettiin suljettuun bioreaktorijärjestelmään (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), joka toimi samoissa fysikaalisissa ja kemiallisissa olosuhteissa. Bioreaktorilla luotiin Master Cell Bank (MCB), joka kerättiin, testattiin, karakterisoitiin ja nopeuden säätelyllä kylmäsäilytettiin yhteensä seitsemän tuplauksen jälkeen (D7).

Kun MCB oli turvallisuustestattu ja karakterisoitu, osa erästä sulatettiin ja käytettiin bioreaktorin kylvämiseen Working Cell Bank (WCB) -tuotantoa varten. Soluja viljeltiin bioreaktorissa, kunnes ne saavuttivat D13:n. Ne kerättiin (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), jaettiin eriin (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) ja kylmäsäilytettiin WCB:n luomiseksi. WCB:lle suoritettiin vapautumistesti turvallisuus- ja karakterisointimäärityksiä varten. Turvallisuustesteihin sisältyi steriiliys (USP <71>), mykoplasma (USP <63), endotoksiini (USP <85>) ja karyotyypitys (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Karakterisointi sisälsi virtaussytometriset testit: 4. lokakuuta >90 % (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488 konjugoitu), Sox-2 >90 % (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488 konjugoitu), MHC-I <10 % (A4, eBioscience; APC-konjugoitu), MHC-II <10 % (CVS20, Novus) Biologicals, Littleton CO, USA; AF488 konjugoitu), CD105 <10 % (SN6, eBioscience; PE-Cy7-konjugoitu) ja tyrosiinihydroksylaasi <10 % (EP1532Y, Abcam, Cambridge, UK; FITC-konjugoitu vuohen anti-kani IgG; ; polyklonaalinen). Sekä MCB:tä että WCB:tä säilytettiin kaasufaasissa LN2 -196 °C:ssa.

Kaikki toimenpiteet suoritettiin aseptisissa olosuhteissa ISO 8 -puhdashuoneessa käyttäen ISO 5 -bioturvallisuuskaappeja ja laminaarisia ilmavirtauskupuja validoitujen protokollien mukaisesti. Soluilla osoitettiin olevan normaali karyotyyppi, eivätkä ne tuottaneet teratomeja immuunipuutteellisilla jyrsijöillä (julkaisemattomat tiedot).

Lääketerapia

Immunosuppressio syklosporiini A:lla annoksella 15 mg/kg/vrk aloitettiin 10 päivää ennen leikkausta ja sitä jatkettiin kuukauden ajan sen jälkeen. Potilaat saivat myös indometasiinia 225 mg/vrk alkaen 10 päivää ennen implantaatiota ja kuuden kuukauden ajan leikkauksen jälkeen sen jälkeen. Laajakirjoinen antibiootti (Zannat 700 mg) annettiin ennen leikkausta ja 48 tuntia leikkauksen jälkeen. Parkinsonin lääkkeet sovitettiin potilaan tarpeiden mukaan.

Stereotaktinen leikkaus

MRI-ohjattu stereotaktinen intraputaminaalinen soluistutus PD-potilaille suoritettiin käyttämällä Leksell Stereotactic System -järjestelmää ja Stealth Station Surgical Navigation System -järjestelmää (Fridley, Minnesota, USA). Ropivakaiinia käytettiin paikallispuudutteena kehyksen sijoittamiseen. Kohdepaikoissa mittaukset tehtiin käyttämällä CT-skannauskuvia, jotka on yhdistetty aikaisempiin MR-kuviin (molemmat DICOM-muodossa, 1,0 mm:n paksuisina aksiaalisissa osissa). Kun potilas oli yleisanestesiassa, stereotaktinen kehys kiinnitettiin leikkauspöytään Mayfieldin päänpitimellä. Kahdenväliset parasagittaaliset viillot ja vastaavat 14 mm:n pursereiät (yksi kullekin pallonpuoliskolle) tehtiin solususpensioinjektioiden valmistelua varten. Kummallekin puolelle valittiin kaksi erilaista neulanjälkeä saman pursereiän läpi. Kohdepaikat määritettiin putaminaalisten ytimien korkeuden ja pituuden perusteella. Kunkin radan alimmat Z-koordinaatit sijaitsivat selkäputamenissa ja 4 mm:n etäisyydellä toisistaan ​​X-suunnassa. Kukin neularata vastaanotti 1 x 106 solua 1 cm3:ssä viljelyalustaa. Täydellisen solususpension annostelun varmistamiseksi injektiot suoritettiin hitaasti 2 minuutin ajan ja syöttöneula poistettiin vastavuoroisesti, jotta vältetään sekä kantasolujen että aivokudoksen vaurioituminen sekä refluksoinnin tai kuplien muodostuminen. Leikkauksen jälkeen potilaita pidettiin tavanomaisessa postoperatiivisessa hoitoyksikössä 1 tunti. Leikkauksen jälkeisenä päivänä otettiin MR-kuvat solususpensioiden oikean sijoittamisen varmistamiseksi. Kaikki potilaat kotiutettiin 24 tuntia leikkauksen jälkeen.

Neurologiset arvioinnit

Tämän tutkimuksen neurologisiin päätepisteisiin sisältyi solusiirteen jälkeisten haittatapahtumien lukumäärän ja vakavuuden arviointi sekä tehokkuus motoristen vasteiden parantamisessa, kuten arvioitiin UPDRS:n osassa I (mentaatio, käyttäytyminen ja mieliala), osassa II (motoriset aktiviteetit). päivittäinen elämä), osa III (motorinen suorituskyky) ja osa IV (terapian komplikaatiot), samoin kuin muunneltu Höehnin ja Yahrin asteikko sekä muokattu Schwab ja England Activity of the Daily Living Scale. Potilaat arvioitiin kliinisesti näillä asteikoilla seulonnassa (perustasona ennen leikkausta) ja sitten toimenpiteen jälkeen kuuden ja 12 kuukauden kuluttua. Jokaisella käynnillä potilaita pyydettiin lopettamaan Parkinson-lääkitys vähintään 12 tuntia ennen UPDRS-arviointia (käytännön syistä "OFF"-tila määriteltiin yön yli tapahtuvaksi lääkkeen vieroitustilaksi), jotta heidät voidaan arvioida "OFF"-tilaansa ja sitten UPDRS-arvoksi. "ON"-lääkitysarvioinnit suoritettiin 1 tunti tavanomaisen levodopa-annoksen saamisen jälkeen. Jokainen potilas sai saman preoperatiivisen levodopaannoksen jokaisessa arvioinnissa. Haittatapahtumat, mukaan lukien potilaiden spontaanisti ilmoittamat ja arviointien aikana havaitut haittatapahtumat kirjattiin. Sen jälkeen, kun kaikilta tutkimuksen suorittaneilta potilailta oli saatu allekirjoitettu tietoinen suostumus, kaikki "OFF" ja "ON" UPDRS-arvioinnit nauhoitettiin.

Neuropsykologiset arvioinnit

Kognitiivinen suorituskyky arvioitiin seuraavilla instrumenteilla: Meksikon mukautukset Beckin ja Steerin ahdistuneisuus [25] ja masennus [26] kartoituksista; lyhyt neuropsykologinen (NEUROPSI)[27,28] ja tietokoneistettu neuropsykologinen testiparistomme sekä Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Potilaat raportoivat elämänlaadustaan ​​liittyen päivittäiseen elämäänsä; fyysinen ja henkinen hyvinvointi (terveydentila); kognitio ja viestintä sekä yksi yhteenvetoindeksi.

Immunogeenisuustestaus

Potilaan verestä arvioitiin hfSC-spesifisten vasta-aineiden tiitterien nousu ja vasta-aineriippuvaisen soluvälitteisen sytotoksisuuden lisääntyminen implantaation jälkeen verrattuna perusarvoihin. Näytteet otettiin kuukautta ennen soluistutusta ja sitten kuukausi ja kuusi kuukautta leikkauksen jälkeen. Jokaiselta potilaalta otettiin kokoverinäytteet ja käsiteltiin seerumina yksi ja kuusi kuukautta siirron jälkeen käyttämällä lipofiilistä kalvoväriä PKH67 (Sigma-Aldrich), kuten valmistaja on kuvannut soluseurantaan immuunivasteessa ja sytotoksisuusmäärityksissä virtaussytometrialla [30, 31]. Sytotoksisuusmääritys suoritettiin 100:1, 50:1 ja 25:1 efektori-kohdesuhteilla.

MRI

MR-kuvat otettiin ennen leikkausta (perustaso) ja kolme kertaa solun istutuksen jälkeen 24 tunnin kuluttua sekä kuusi ja 12 kuukautta leikkauksen jälkeen. Ne hankittiin 3 Teslan magneetilla, MR Systems Achieva versio 2.6.3.8 Philips (paras, Alankomaat).

PET-molekyylikuvaus

Potilaille tehtiin PET-molekyylikuvaus lähtötilanteessa, kuuden kuukauden kuluttua (tietoja ei esitetty) ja vuoden kuluttua hfSC-istutuksesta. Käytetyt radiofarmaseuttiset aineet olivat (+)-alfa-[11C]dihidrotetrabenatsiini (DTBZ), 6-[18F]fluori-L-DOPA (FDOPA) ja [11C]raklopridi (RAC). Kaikille potilaille tehtiin DTBZ-PET-skannaukset ja yksi lisätutkimus joko FDOPA:lla tai RAC:lla vähintään viikon välein. Potilaita pyydettiin lopettamaan Parkinson-lääkitys vähintään 12 tuntia ennen jokaista tutkimusta. Kuvat hankittiin Siemens Biograph 64 PET/CT -laitteella. 30 minuutin aivojen emissiokuvaukset otettiin 20 minuuttia DTBZ:n tai RAC:n injektion jälkeen, kun taas 15 minuutin skannaukset FDOPA:lle 75 minuuttia injektion jälkeen. Kaikki FDOPA:lla tutkitut potilaat saivat esilääkityksen 150 mg:lla karbidopaa perifeerisen dekarboksylaation estämiseksi. Kuvat rekonstruoitiin käyttämällä OSEM-2D-algoritmia ja analysoitiin ohjelmistolla Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Jokainen yksittäinen PET-aivokuva normalisoitiin anatomisella MRI-kartalla arvioitavaksi standarditilassa. Normalisoinnin jälkeen kiinnostavien alueiden määrittämiseen käytettiin FSL-rakennekartastoja. Kvantitatiivisen analyysin helpottamiseksi spesifiset sisäänottosuhteet (SUR) häntäpäässä ja putamenissa laskettiin vähentämällä aivojuovion aktiivisuudesta epäspesifisen oton referenssialueen taustasignaali ja jakamalla se vertailualueen aktiivisuudella [(kohdeotto - referenssiotto)/vertailu sisäänotto] käyttämällä okcipitaalista aivokuorta (DTBZ ja FDOPA) ja pikkuaivoja (RAC) vertailualueina.

Tilastollinen analyysi

Vertailut lähtötilanteen ja 12 kuukauden seurantamittausten välillä ahdistuneisuuden, masennuksen, NEUROPSI-, MMPSE-tutkimusten, oikean ja vasemman sormen napautuksen välillä "ON"- ja "OFF"-lääkitystiloissa suoritettiin käyttämällä Wilcoxon-testiä. Kaikki muut loppumittaukset ilmoitettiin kunkin potilaan yksilöllisinä tuloksina.