Parkinsonisk hjärnreparation med hjälp av mänskliga stamceller (HSCfPD)

Denna studie är en longitudinell, prospektiv, interventionell, okontrollerad studie utformad för att testa, för det första, säkerheten och för det andra den potentiella effekten av intraputaminal transplantation av odifferentierad hfSC för behandling av PD. Patienterna övervakades noggrant för eventuella biverkningar. Alla patienter genomgick baslinje- och neurologiska, neuropsykologiska, MRT- och PET-utvärderingar 6 och 12 månader efter operationen.

Upphandling, isolering, expansion och karakterisering av hfSC, samt bedömning av patienternas immunsvar på hfSC-transplantation, utfördes vid Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA USA). Patienturval, neurologiska, neuropsykologiska och MRT-utvärderingar före och efter operationen, såväl som stereotaktisk kirurgi och vård efter operation, utfördes på Hospital Angeles del Pedregal (Mexico City, Mexiko). Syntes av radiofarmaka och PET-avbildning utfördes vid Radiopharmacy-Cyclotron Unit vid Medicinska fakulteten, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexico City, Mexiko). Åtta patienter med måttlig till avancerad PD valdes ut för denna studie. En av patienterna förlorades för att följa upp på grund av orsaker som inte var relaterade till denna studie. Försökspersoner som fullföljde uppföljningen var 2 kvinnor och 5 män, med åldrar mellan 43-74 år (medelålder 56 år).

Upphandling och utbyggnad av hfSC

Mänsklig fosterhjärnvävnad anskaffades via rutinmässiga sterila manuella aspirationsmetoder med informerat samtycke från givaren i enlighet med NIH:s riktlinjer för användning av fostervävnad samt federala och statliga lagar. Vävnadsdonator och hfSC-mottagare förblev okända för varandra.

Moderns blodprov (sera) testades för: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) hepatit A, B och C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test and Reflex FTA) och cytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Kvinnor med en historia av genital herpes, cancer, astma, lupus, reumatoid artrit, allergier, vaskulit av autoimmunt ursprung och drogmissbruk exkluderades. Dräktigheten bestämdes enligt Carnegies stadier. Fostervävnad skördades vid den sjätte graviditetsveckan efter elektiv abort. Fosterhjärnan dissekerades, maldes och triturerades till en enstaka cellsuspension. Celler odlades i kolvar inkuberade vid 37°C under hypoxiska förhållanden (5% O2 och 5% CO2) genom 4 fördubblingar. Vid den andra dubbleringen (D2) testades cellodling för sterilitet (USP <71>) och vid D4 karyotypades kulturen och PCR-testades för närvaro av oavsiktliga agens: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatit A, B och C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Celler överfördes sedan till ett slutet bioreaktorsystem (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), som arbetar under samma fysikaliska och kemiska förhållanden. Bioreaktorn användes för att skapa Master Cell Bank (MCB), som skördades, testades, karakteriserades och kryokonserverades med hastighetskontroll efter totalt sju fördubblingar (D7).

Efter att MCB säkerhetstestats och karakteriserats, tinades en del av satsen och användes för att ympa bioreaktorn för produktionen av Working Cell Bank (WCB). Celler odlades i bioreaktorn tills de nådde D13. De skördades (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), alikvoterades (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) och kryokonserverades för att skapa en WCB. WCB utsattes för frisättningstestning för säkerhets- och karakteriseringsanalyser. Säkerhetstestning inkluderade sterilitet (USP <71>), mykoplasma (USP <63), endotoxin (USP <85>) och karyotypning (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Karakterisering inkluderade flödescytometritestning för: okt-4 >90 % (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488-konjugerad), Sox-2 >90 % (Btjce, eBioscience, San Diego, CA, USA; AF488-konjugerad), MHC-I <10 % (A4, eBioscience; APC-konjugerad), MHC-II <10 % (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488-konjugerad), CD105 <10 % (SN6, eBioscience; PE-Cy7-konjugerad) och tyrosinhydroxylas <10 % (EP1532Y, Abcam, Cambridge, Storbritannien; FITC-konjugerad get-anti-kanin IgG; Abcam polyklonal). Både MCB och WCB lagrades i gasfas LN2 vid -196°C.

Alla procedurer utfördes under aseptiska förhållanden i ett ISO 8-renrum, med användning av ISO 5 biosäkerhetsskåp och laminära luftflödeshuvar, enligt validerade protokoll. Celler visades ha en normal karyotyp och producerade inte teratom hos immunkomprometterade gnagare (opublicerade data).

Farmakoterapi

Immunsuppression via ciklosporin A vid en dos av 15 mg/kg/dag påbörjades 10 dagar före operationen och fortsatte i en månad därefter. Patienterna fick också indometacin 225 mg/dag, med början 10 dagar före implantation och sex månader efter operationen därefter. Bredspektrumantibiotikum (Zannat 700 mg) gavs preoperativt och 48 timmar postoperativt. Antiparkinsonmediciner anpassades till patientens behov.

Stereotaktisk kirurgi

MRT-styrd stereotaktisk intraputaminal cellimplantation i PD-patienter utfördes med ett Leksell Stereotactic System och Stealth Station Surgical Navigation System (Fridley, Minnesota, USA). Ropivacaine användes som lokalbedövning för ramplacering. För målplatser gjordes mätningar med CT-skanningsbilder sammansmälta med tidigare MR-bilder (båda i DICOM-format, i axiella sektioner 1,0 mm tjocka). Med patienten under allmän narkos fixerades den stereotaktiska ramen vid operationsbordet med en Mayfield-huvudhållare. Bilaterala parasagittala snitt och motsvarande 14 mm borrhål (ett för varje hemisfär) gjordes som förberedelse för cellsuspensionsinjektioner. Två olika nålspår genom samma borrhål valdes för varje sida. Målplatser bestämdes av höjden och längden av putaminala kärnor. De lägsta Z-koordinaterna för varje spår var belägna i den dorsala putamen och placerade 4 mm från varandra i X-riktningen. Varje nålspår fick 1X106 celler i 1 cc odlingsmedium. För att säkerställa fullständig leverans av cellsuspension utfördes injektioner långsamt under 2 minuter med ömsesidigt tillbakadragande av leveransnålen för att undvika både skador på stamceller och hjärnvävnad, såväl som för att förhindra reflux eller bubbelbildning. Efter operationen hölls patienterna på en konventionell postoperativ vårdenhet i 1 timme. Dagen efter operationen togs MR-bilder för att bekräfta korrekt placering av cellsuspensioner. Alla patienter skrevs ut 24 timmar efter operationen.

Neurologiska utvärderingar

Neurologiska effektmått för denna studie inkluderade utvärdering av antalet och svårighetsgraden av biverkningar efter celltransplantation, och effektiviteten i förbättringen av motoriska svar, som bedömts på UPDRS del I (mentation, beteende och humör), del II (motoriska aktiviteter av det dagliga livet), del III (motorisk prestation) och del IV (komplikationer av terapi), såväl som den modifierade Höehn och Yahr-skalan och de modifierade Schwab- och Englandsaktiviteterna i Daily Living-skalan. Patienterna utvärderades kliniskt med dessa skalor vid screening (som baslinje, före operation) och sedan efter proceduren vid sex och 12 månader. Vid varje besök ombads patienter att avbryta läkemedel mot Parkinson minst 12 timmar före UPDRS-bedömningen (av praktiska skäl definierades "AV"-tillståndet som uttag av läkemedel över natten) för att bedömas i sitt "AV"-tillstånd och sedan UPDRS "ON"-läkemedelsutvärderingar utfördes 1 timme efter att de fått sin vanliga dos av levodopa. Varje patient fick samma preoperativa levodopados för varje bedömning. Biverkningar, inklusive de som rapporterats av patienterna spontant och de som observerats under utvärderingarna, registrerades. Efter att ha erhållit undertecknat informerat samtycke från alla patienter som slutförde studien filmades alla "AV" och "PÅ" UPDRS-utvärderingar.

Neuropsykologiska utvärderingar

Kognitiv prestation utvärderades med hjälp av följande instrument: Mexikanska anpassningar av Beck och Steers ångest [25] och depression [26] inventeringar; våra korta neuropsykologiska (NEUROPSI)[27,28] och datoriserade neuropsykologiska testbatterier, och Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Patienter rapporterade om sin livskvalitet relaterad till deras dagliga aktiviteter; fysiskt och psykiskt välbefinnande (hälsostatus); kognition och kommunikation, och ett sammanfattande index.

Immunogenicitetstestning

Patientens blod utvärderades för ökning av titrar av hfSC-specifika antikroppar och för ökning av antikroppsberoende cellförmedlad cytotoxicitet efter implantation jämfört med baslinjevärden. Prover togs en månad före cellimplantation och sedan en månad och sex månader efter operationen. Helblodsprover togs från varje patient och bearbetades som serum en och sex månader efter ympning med det lipofila membranfärgämnet PKH67 (Sigma-Aldrich) som beskrivs av tillverkaren för cellspårning i immunsvar och cytotoxicitetsanalyser med flödescytometri [30, 31]. Cytotoxicitetsanalys utfördes med 100:1, 50:1 och 25:1 effektor till målförhållanden.

MRI

MR-bilder erhölls före operation (baslinje) och tre gånger efter cellimplantation vid 24 timmar och sex och 12 månader efter operationen. De köptes med en 3 Tesla-magnet, MR Systems Achieva release 2.6.3.8 Philips (Bäst, Nederländerna).

PET molekylär avbildning

Patienterna genomgick molekylär PET-avbildning vid baslinjen, sex månader (data presenteras ej) och ett år efter hfSC-implantation. Radiofarmaka som användes var (+)-alfa-[11C]Dihidrotetrabenazin (DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA (FDOPA) och [11C]Raclopride (RAC). Alla patienter genomgick DTBZ-PET-skanningar och ytterligare en studie med antingen FDOPA eller RAC, med minst en veckas mellanrum. Patienterna ombads att avbryta antiparkinsonmediciner minst 12 timmar före varje studie. Skanningar förvärvades på en Siemens Biograph 64 PET/CT. Trettio minuter långa hjärnemissionsskanningar förvärvades 20 minuter efter injektion av DTBZ eller RAC, medan 15 minuters skanningar förvärvades för FDOPA 75 minuter efter injektion. Alla patienter som studerats med FDOPA förmedicinerades med 150 mg karbidopa för att förhindra perifer dekarboxylering. Bilder rekonstruerades med hjälp av en OSEM-2D-algoritm och analyserades med programvaran Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Varje enskild PET-hjärnabild normaliserades på en anatomisk MRI-atlas för att utvärderas inom ett standardutrymme. Efter normalisering användes FSL-strukturatlaser för definition av de intressanta regionerna. För att underlätta den kvantitativa analysen beräknades specifika upptagsförhållanden (SUR) i caudat och putamen genom att subtrahera bakgrundssignalen för en referensregion med ospecifik upptagning från striatal aktivitet och dividera med referensregionaktivitet [(målupptag - referensupptag)/referens upptag], med användning av occipital cortex (DTBZ och FDOPA) och cerebellum (RAC), som referensregioner.

Statistisk analys

Jämförelser mellan baslinje- och 12-månaders uppföljningsmätningar för ångest, depression, NEUROPSI, MMPSE-undersökningar, höger- och vänsterfingerknackning i "ON" och "OFF" medicineringstillstånd utfördes med Wilcoxon-testet. Alla andra slutmått rapporterades som individuella resultat för varje patient.