Parkinson-kóros agyjavítás emberi őssejtek felhasználásával (HSCfPD)

Ez a vizsgálat egy longitudinális, prospektív, intervenciós, nem ellenőrzött vizsgálat, amelynek célja egyrészt a PD kezelésére szolgáló, differenciálatlan hfSC intraputaminális beültetésének biztonságosságának, másodsorban potenciális hatékonyságának tesztelése. A betegeket gondosan ellenőrizték az esetleges mellékhatások tekintetében. Minden betegnél kiindulási és 6 és 12 hónapos műtét utáni neurológiai, neuropszichológiai, MRI és PET kiértékelésen esett át.

A hfSC beszerzését, izolálását, kiterjesztését és jellemzését, valamint a betegek hfSC átültetésre adott immunválaszának felmérését a Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA, USA) végezte. A betegek kiválasztását, a műtét előtti és utáni neurológiai, neuropszichológiai és MRI értékeléseket, valamint a sztereotaxiás műtétet és a műtét utáni ellátást az Angeles del Pedregal kórházban (Mexikóváros, Mexikó) végezték. A radiofarmakon szintézisét és a PET képalkotást az Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexikóváros, Mexikó) Orvostudományi Kar Radiopharmacy-Cyclotron osztályán végezték. Nyolc közepesen előrehaladott PD-ben szenvedő beteget választottak ki ebbe a vizsgálatba. Az egyik beteget a vizsgálattal nem összefüggő okok miatt nem kellett nyomon követni. Az utánkövetést végző alanyok 2 nő és 5 férfi voltak, életkoruk 43-74 év (átlagéletkor 56 év).

A hfSC beszerzése és bővítése

Az emberi magzati agyszövetet rutin steril kézi aspirációs módszerekkel szerezték be, a donor tájékozott beleegyezésével, összhangban az NIH magzati szövethasználatra vonatkozó irányelveivel, valamint a szövetségi és állami törvényekkel. A szövetdonor és a hfSC recipiensek ismeretlenek maradtak egymás számára.

Az anyai vérmintákat (szérumokat) a következőkre vizsgálták: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) hepatitis A, B és C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test and reflex FTA) és citomegalovírus (Quest, Oxnard CA). Kizárták azokat a nőket, akiknek a kórtörténetében genitális herpesz, rák, asztma, lupus, rheumatoid arthritis, allergia, autoimmun eredetű vasculitis és kábítószerrel való visszaélés szerepelt. A terhességet a Carnegie-stádiumok szerint határoztuk meg. A magzati szövetet a terhesség hatodik hetében gyűjtöttük be az elektív abortusz után. A magzati agyat feldaraboltuk, feldaraboltuk és egysejt-szuszpenzióvá trituráltuk. A sejteket 37 °C-on, hipoxiás körülmények között (5% O2 és 5% CO2) inkubált lombikban tenyésztettük 4 megkettőzésig. A második duplázódásnál (D2) a sejttenyészet sterilitását teszteltük (USP <71>), a D4-nél pedig kariotipizáltuk a tenyészetet, és PCR-teszttel végeztük a járulékos ágensek jelenlétét: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatitis A, B és C, T. o. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. A sejteket ezután egy zárt bioreaktor rendszerbe (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE) vittük át, amely azonos fizikai és kémiai körülmények között működött. A bioreaktort a Master Cell Bank (MCB) létrehozására használták, amelyet összesen hét megkettőzés után (D7) gyűjtöttek be, teszteltek, jellemeztek és sebességszabályozással mélyhűtöttek.

Miután az MCB-t biztonságosan tesztelték és jellemezték, a tétel egy részét felolvasztották, és a bioreaktor beoltására használták fel a Working Cell Bank (WCB) előállításához. A sejteket a bioreaktorban tenyésztjük, amíg el nem érték a D13-at. Betakarították őket (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), aliquot részekre osztották (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA), és mélyhűtötték, hogy létrehozzák a WCB-t. A WCB-t felszabadulási tesztnek vetettük alá biztonsági és jellemzési vizsgálatok céljából. A biztonsági tesztek között szerepelt a sterilitás (USP <71>), a mikoplazma (USP <63), az endotoxin (USP <85>) és a kariotipizálás (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). A jellemzés áramlási citometriás vizsgálatot tartalmazott: okt-4 >90% (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488 konjugált), Sox-2 >90% (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488 konjugált), MHC-I <10% (A4, eBioscience; APC konjugált), MHC-II <10% (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488 konjugált), CD105 <10% (SN6, eBioscience; PE-Cy7 konjugált) és tirozin-hidroxiláz <10% (EP1532Y, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság; FITC konjugált kecske anti-nyúl nyúl IgG; ; poliklonális). Mind az MCB-t, mind a WCB-t LN2 gázfázisban tároltuk -196 °C-on.

Minden eljárást aszeptikus körülmények között, ISO 8 tisztaszobában végeztek, ISO 5 biológiai biztonsági szekrények és lamináris légelszívó burkolatok felhasználásával, az érvényesített protokollok szerint. Kimutatták, hogy a sejtek normális kariotípussal rendelkeznek, és nem termeltek teratomákat immunhiányos rágcsálókban (nem publikált adatok).

Farmakoterápia

A ciklosporin A 15 mg/ttkg/nap dózisú immunszuppresszióját 10 nappal a műtét előtt kezdték meg, majd egy hónapig folytatták. A betegek napi 225 mg indomethacint is kaptak, 10 nappal a beültetés előtt, majd hat hónapig a műtét után. Széles spektrumú antibiotikumot (700 mg Zannat) adtak a műtét előtt és 48 órával a műtét után. Az antiparkinson gyógyszereket a páciens igényeihez igazították.

Sztereotaktikus műtét

MRI-vezérelt sztereotaktikus intraputaminális sejtbeültetést PD betegekbe Leksell Stereoactic System és Stealth Station Surgical Navigation System (Fridley, Minnesota, USA) segítségével végeztünk. A ropivakaint helyi érzéstelenítőként alkalmazták a keret elhelyezéséhez. A célhelyek esetében a méréseket korábbi MR-képekkel összeöntött CT-scan képekkel végeztük (mindkettő DICOM formátumban, 1,0 mm vastag axiális metszetekben). A beteg általános érzéstelenítésben a sztereotaxiás keretet Mayfield fejtartóval rögzítették a műtőasztalhoz. Kétoldali parasagittalis bemetszéseket és a megfelelő 14 mm-es sorjalyukakat (mindegyik féltekéhez egyet) készítettünk a sejtszuszpenziós injekciók előkészítéseként. Mindkét oldalon két különböző tűnyomot választottak ki ugyanazon a sorjalyukon keresztül. A célpontokat a putaminális magok magassága és hossza alapján határoztuk meg. Az egyes pályák legalacsonyabb Z-koordinátái a hátsó putamenben helyezkedtek el, és 4 mm-re helyezkedtek el egymástól az X-irányban. Mindegyik tűsáv 1 x 106 sejtet kapott 1 cm3 tápközegben. A teljes sejtszuszpenzió bejuttatása érdekében az injekciókat lassan, 2 percig végeztük, a tű kölcsönös kihúzásával, hogy elkerüljük az őssejtek és az agyszövet károsodását, valamint elkerüljük a refluxot vagy a buborékképződést. A műtét után a betegeket 1 órán át hagyományos posztoperatív osztályon tartották. A műtétet követő napon MR-felvételeket készítettünk a sejtszuszpenziók helyes elhelyezésének megerősítésére. Minden beteget a műtét után 24 órával hazaengedtek.

Neurológiai értékelések

E vizsgálat neurológiai végpontjai közé tartozott a sejtátültetés utáni nemkívánatos események számának és súlyosságának értékelése, valamint a motoros válaszok javulásának hatékonysága, amint azt az UPDRS I. része (mentáció, viselkedés és hangulat), II. a mindennapi életvitel), a III. rész (motoros teljesítmény) és a IV. rész (a terápia szövődményei), valamint a módosított Höehn és Yahr Skála, valamint a Daily Living Scale módosított Schwab és Anglia tevékenységei. A betegeket ezekkel a skálákkal klinikailag értékelték a szűréskor (kiindulásként, műtét előtt), majd a beavatkozás után hat és 12 hónapos korban. Minden vizit alkalmával a betegeket arra kérték, hogy hagyják abba a Parkinson-kór elleni gyógyszerek szedését legalább 12 órával az UPDRS-értékelés előtt (a gyakorlati okokból az "OFF" állapotot éjszakai gyógyszerelvonásként határozták meg), hogy "OFF" állapotukban értékeljék őket, majd az UPDRS-t. Az "ON" gyógyszeres értékelést 1 órával a szokásos levodopa adag bevétele után végezték el. Mindegyik beteg ugyanazt a preoperatív levodopa dózist kapta minden egyes értékeléshez. Feljegyeztük a nemkívánatos eseményeket, beleértve azokat, amelyeket a betegek spontán jelentettek, és azokat, amelyeket az értékelés során észleltek. Miután megkapták a vizsgálatot befejező összes beteg aláírt beleegyezését, az összes "OFF" és "ON" UPDRS értékelést videóra vették.

Neuropszichológiai értékelések

A kognitív teljesítményt a következő eszközökkel értékelték: Beck és Steer szorongás [25] és depresszió [26] leltárainak mexikói adaptációi; rövid neuropszichológiai (NEUROPSI)[27,28] és számítógépes neuropszichológiai tesztelemeink, valamint a Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. A betegek életminőségükről számoltak be a mindennapi életvitelükhöz kapcsolódóan; testi és lelki jólét (egészségügyi állapot); megismerés és kommunikáció, valamint egy összefoglaló index.

Immunogenitási vizsgálat

A páciens vérét értékelték a hfSC-specifikus antitestek titerének növekedésére és az antitest-függő sejt-közvetített citotoxicitás növekedésére a beültetés után az alapértékekhez képest. A mintákat egy hónappal a sejtbeültetés előtt, majd egy hónappal és hat hónappal a műtét után vettük. Minden betegtől teljes vérmintákat vettünk, és szérumként dolgoztuk fel az átültetés után egy és hat hónappal a PKH67 (Sigma-Aldrich) lipofil membránfestékkel, ahogy azt a gyártó leírta az immunválasz és a citotoxicitási vizsgálatok sejtkövetésére áramlási citometriával [30, 31]. A citotoxicitási vizsgálatot 100:1, 50:1 és 25:1 effektor-cél aránnyal végeztük.

MRI

Az MR-képeket a műtét előtt (alapvonal) és háromszor a sejtbeültetés után 24 órával, valamint hat és 12 hónappal a műtét után készítettük. 3 Tesla mágnessel, MR Systems Achieva 2.6.3.8 kiadással szerezték be Philips (Legjobb, Hollandia).

PET molekuláris képalkotás

A betegek PET-molekuláris képalkotáson estek át a kiinduláskor, hat hónappal (az adatokat nem közölték) és egy évvel a hfSC beültetése után. A felhasznált radiofarmakonok a következők voltak: (+)-alfa-[11C]dihidrotetrabenazin (DTBZ), 6-[18F]fluor-L-DOPA (FDOPA) és [11C]racloprid (RAC). Minden beteg DTBZ-PET-vizsgálaton és egy további vizsgálaton esett át FDOPA-val vagy RAC-val, legalább egy hét különbséggel. A betegeket arra kérték, hogy minden egyes vizsgálat előtt legalább 12 órával hagyják abba a Parkinson-kór elleni gyógyszerek szedését. A szkenneléseket Siemens Biograph 64 PET/CT készüléken végeztük. A DTBZ vagy RAC injekció beadása után 20 perccel 30 perces agyemissziós felvételeket, míg az FDOPA esetében 75 perccel az injekció beadása után 15 perces vizsgálatokat végeztünk. Minden FDOPA-val vizsgált beteget 150 mg karbidopával előzetesen kezeltek a perifériás dekarboxiláció megelőzése érdekében. A képeket OSEM-2D algoritmussal rekonstruáltuk, és a Statistical Parametric Mapping (SPM v.12) szoftverrel elemeztük. Minden egyes PET agyképet anatómiai MRI atlaszon normalizáltunk, hogy egy standard térben értékeljük ki. A normalizálást követően FSL szerkezeti atlaszokat használtunk az érdeklődésre számot tartó régiók meghatározásához. A kvantitatív elemzés megkönnyítése érdekében a fajlagos felvételi arányokat (SUR) a caudatusban és a putamenben úgy számítottuk ki, hogy a striatális aktivitásból kivontuk a nem specifikus felvételt mutató referenciarégió háttérjelét, és elosztottuk a referencia régió aktivitásával [(célfelvétel - referencia felvétel)/referencia. felvétel], referenciarégióként az occipitalis kéreg (DTBZ és FDOPA) és a kisagy (RAC) felhasználásával.

Statisztikai analízis

A szorongás, depresszió, NEUROPSI, MMPSE vizsgálatok kiindulási és 12 hónapos követéses mérései, valamint a jobb és bal ujj ütögetése „ON” és „OFF” gyógyszeres állapotban végzett összehasonlítása a Wilcoxon teszttel történt. Az összes többi végintézkedést egyéni eredményként jelentették minden egyes betegnél.