Parkinsonisk hjernereparation ved hjælp af menneskelige stamceller (HSCfPD)

Dette forsøg er et longitudinelt, prospektivt, interventionelt, ukontrolleret studie designet til for det første at teste sikkerheden og for det andet den potentielle effektivitet af intraputaminal grafting af udifferentieret hfSC til behandling af PD. Patienterne blev overvåget omhyggeligt for eventuelle bivirkninger. Alle patienter gennemgik baseline og 6- og 12-måneders post-kirurgiske neurologiske, neuropsykologiske, MR- og PET-evalueringer.

Fremskaffelse, isolering, udvidelse og karakterisering af hfSC samt vurdering af patienters immunrespons på hfSC-transplantation blev udført hos Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA USA). Patientudvælgelse, neurologiske, neuropsykologiske og MR-evalueringer før og efter operationen samt stereotaktisk kirurgi og post-kirurgisk behandling blev udført på Hospital Angeles del Pedregal (Mexico City, Mexico). Syntese af radiofarmaceutiske stoffer og PET-billeddannelse blev udført på Radiopharmacy-Cyclotron Unit på Det Medicinske Fakultet, Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexico City, Mexico). Otte patienter med moderat til fremskreden PD blev udvalgt til dette forsøg. En af patienterne gik tabt til opfølgning på grund af årsager, der ikke var relateret til denne undersøgelse. Forsøgspersoner, der fuldførte opfølgningen, var 2 kvinder og 5 mænd, med alderen mellem 43-74 år (gennemsnitsalder 56 år).

Indkøb og udvidelse af hfSC

Humant føtalt hjernevæv blev fremskaffet via rutinemæssige sterile manuelle aspirationsmetoder med informeret samtykke fra donoren i overensstemmelse med NIH-retningslinjer for brug af føtalt væv samt føderale og statslige love. Vævsdonor- og hfSC-modtagere forblev ukendte for hinanden.

Maternelle blodprøver (sera) blev testet for: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) hepatitis A, B og C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Agglutination Slide Test and Reflex FTA) og cytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Kvinder med en historie med genital herpes, cancer, astma, lupus, reumatoid arthritis, allergier, vaskulitis af autoimmun oprindelse og stofmisbrug blev udelukket. Drægtighed blev bestemt i henhold til Carnegie stadier. Fostervæv blev høstet ved den sjette graviditetsuge efter elektiv abort. Fosterhjerne blev dissekeret, hakket og tritureret til en enkelt cellesuspension. Celler blev dyrket i kolber inkuberet ved 37°C under hypoxiske betingelser (5% O2 og 5% CO2) gennem 4 fordoblinger. Ved den anden fordobling (D2) blev cellekultur testet for sterilitet (USP <71>), og ved D4 blev kulturen karyotypebestemt og PCR testet for tilstedeværelse af utilsigtede stoffer: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatitis A, B og C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Celler blev derefter overført til et lukket bioreaktorsystem (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), der fungerede under de samme fysiske og kemiske betingelser. Bioreaktoren blev brugt til at skabe Master Cell Bank (MCB), som blev høstet, testet, karakteriseret og hastighedskontrol kryokonserveret efter i alt syv fordoblinger (D7).

Efter at MCB var sikkerhedstestet og karakteriseret, blev en del af batchen optøet og brugt til at udså bioreaktoren til Working Cell Bank (WCB) produktion. Celler blev dyrket i bioreaktoren, indtil de nåede D13. De blev høstet (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), alikvoteret (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) og kryokonserveret for at skabe en WCB. WCB'en blev udsat for frigivelsestest for sikkerheds- og karakteriseringsassays. Sikkerhedstest inkluderede sterilitet (USP <71>), mycoplasma (USP <63), endotoksin (USP <85>) og karyotyping (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Karakterisering inkluderede flowcytometritestning for: Okt-4 >90 % (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488 konjugeret), Sox-2 >90% (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488 konjugeret), MHC-I <10% (A4, eBioscience; APC konjugeret), MHC-II <10% (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488-konjugeret), CD105 <10 % (SN6, eBioscience; PE-Cy7-konjugeret) og tyrosinhydroxylase <10 % (EP1532Y, Abcam, Cambridge, UK; FITC-konjugeret gede-anti-kanin IgG; Abcam polyklonal). Både MCB og WCB blev opbevaret i gasfase LN2 ved -196°C.

Alle procedurer blev udført under aseptiske forhold i et ISO 8-renrum ved brug af ISO 5 biosikkerhedsskabe og laminære luftstrømshætter i henhold til validerede protokoller. Celler blev vist at have en normal karyotype og producerede ikke teratomer i immunkompromitterede gnavere (upublicerede data).

Farmakoterapi

Immunsuppression via cyclosporin A ved en dosis på 15 mg/kg/dag blev startet 10 dage før operationen og fortsatte i en måned derefter. Patienterne fik også Indomethacin 225 mg/dag, startende 10 dage før implantation og i seks måneder postoperativt derefter. Bredspektret antibiotikum (Zannat 700 mg) blev givet præoperativt og 48 timer postoperativt. Antiparkinsonmedicin blev tilpasset til patientens behov.

Stereotaktisk kirurgi

MRI-styret stereotaktisk intraputaminal celleimplantation i PD-patienter blev udført ved hjælp af et Leksell Stereotactic System og Stealth Station Surgical Navigation System (Fridley, Minnesota, USA). Ropivacain blev brugt som et lokalbedøvelsesmiddel til rammeplacering. For målplaceringer blev målinger foretaget ved hjælp af CT-scanningsbilleder fusioneret med tidligere MR-billeder (begge i DICOM-format, i aksiale snit 1,0 mm tykke). Med patienten under generel anæstesi blev den stereotaktiske ramme fastgjort til operationsbordet med en Mayfield hovedholder. Bilaterale parasagittale snit og tilsvarende 14 mm grathuller (én for hver halvkugle) blev lavet som forberedelse til cellesuspensionsinjektioner. To forskellige nålespor gennem det samme grathul blev valgt til hver side. Målplaceringer blev bestemt ved højde og længde af putaminale kerner. De laveste Z-koordinater for hvert spor var placeret i den dorsale putamen og med en afstand på 4 mm fra hinanden i X-retningen. Hvert nålespor modtog 1X106 celler i 1 cm3 dyrkningsmedium. For at sikre fuldstændig levering af cellesuspension blev injektioner udført langsomt i 2 minutter med gensidig tilbagetrækning af leveringsnålen for at undgå både beskadigelse af stamceller og hjernevæv samt for at undgå refluks eller bobledannelse. Efter operationen blev patienterne holdt i en konventionel postoperativ plejeenhed i 1 time. Dagen efter operationen blev der taget MR-billeder for at bekræfte korrekt placering af cellesuspensioner. Alle patienter blev udskrevet 24 timer efter operationen.

Neurologiske evalueringer

Neurologiske endepunkter for denne undersøgelse omfattede evaluering af antallet og sværhedsgraden af ​​uønskede hændelser efter celletransplantation og effektiviteten i forbedringen af ​​motoriske responser, som vurderet på UPDRS del I (mentation, adfærd og humør), del II (motoriske aktiviteter af det daglige liv), del III (motorisk ydeevne) og del IV (komplikationer ved terapi), samt den modificerede Höehn og Yahr-skala, og de modificerede Schwab og Englands aktiviteter i Daily Living-skalaen. Patienterne blev klinisk evalueret med disse skalaer ved screening (som baseline, før operation) og derefter efter proceduren efter seks og 12 måneder. Ved hvert besøg blev patienter bedt om at seponere antiparkinsonmedicin mindst 12 timer før UPDRS-vurderingen (af praktiske årsager blev "OFF"-tilstand defineret som medicinabstinens natten over) for at blive vurderet i deres "OFF"-tilstand og derefter UPDRS "ON" medicinevalueringer blev udført 1 time efter at have modtaget deres sædvanlige dosis levodopa. Hver patient fik den samme præoperative levodopadosis for hver vurdering. Bivirkninger, herunder dem, der blev rapporteret af patienterne spontant, og dem, der blev observeret under evalueringerne, blev registreret. Efter at have opnået underskrevet informeret samtykke fra alle patienter, der gennemførte undersøgelsen, blev alle "OFF" og "ON" UPDRS-evalueringer optaget på video.

Neuropsykologiske evalueringer

Kognitiv præstation blev evalueret ved hjælp af følgende instrumenter: Mexicanske tilpasninger af Beck og Steers angst [25] og depression [26] opgørelser; vores korte neuropsykologiske (NEUROPSI)[27,28] og computeriserede neuropsykologiske testbatterier og Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Patienter rapporterede om deres livskvalitet som relateret til deres daglige aktiviteter; fysisk og mentalt velvære (sundhedsstatus); kognition og kommunikation, og et sammenfattende indeks.

Immunogenicitetstest

Patientens blod blev evalueret for stigning i titere af hfSC-specifikke antistoffer og for stigning i antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet efter implantation sammenlignet med basislinjeværdier. Prøver blev udtaget en måned før celleimplantation og derefter en måned og seks måneder efter operationen. Fuldblodsprøver blev opsamlet fra hver patient og behandlet som serum en og seks måneder efter transplantation under anvendelse af det lipofile membranfarvestof PKH67 (Sigma-Aldrich) som beskrevet af producenten til cellesporing i immunrespons og cytotoksicitetsassays ved flowcytometri [30, 31]. Cytotoksicitetsassay blev udført med 100:1, 50:1 og 25:1 effektor-til-mål-forhold.

MR

MR-billeder blev taget før operationen (baseline) og tre gange efter celleimplantation 24 timer og seks og 12 måneder efter operationen. De blev erhvervet med en 3 Tesla-magnet, MR Systems Achieva release 2.6.3.8 Philips (Bedst, Holland).

PET molekylær billeddannelse

Patienterne gennemgik PET-molekylær billeddannelse ved baseline, seks måneder (data ikke præsenteret) og et år efter hfSC-implantation. De anvendte radiofarmaceutiske midler var (+)-alfa-[11C]Dihidrotetrabenazin (DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA (FDOPA) og [11C]Raclopride (RAC). Alle patienter gennemgik DTBZ-PET-scanninger og en yderligere undersøgelse med enten FDOPA eller RAC med mindst en uges mellemrum. Patienterne blev bedt om at seponere antiparkinsonmedicin mindst 12 timer før hver undersøgelse. Scanninger blev erhvervet på en Siemens Biograph 64 PET/CT. Tredive minutters hjerneemissionsscanninger blev erhvervet 20 minutter efter injektion af DTBZ eller RAC, mens 15 minutters scanninger blev erhvervet for FDOPA 75 minutter efter injektion. Alle patienter undersøgt med FDOPA blev præmedicineret med 150 mg carbidopa for at forhindre perifer decarboxylering. Billeder blev rekonstrueret ved hjælp af en OSEM-2D-algoritme og analyseret med softwaren Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Hvert individuelt PET-hjernebillede blev normaliseret på et anatomisk MR-atlas for at blive evalueret inden for et standardrum. Efter normalisering blev FSL strukturelle atlas brugt til definition af regionerne af interesse. For at lette den kvantitative analyse blev specifikke optagelsesforhold (SUR) i caudat og putamen beregnet ved at trække baggrundssignalet fra en referenceregion med uspecifik optagelse fra striatal aktivitet og dividere med referenceregionaktivitet [(måloptagelse - referenceoptagelse)/reference optagelse], ved brug af occipital cortex (DTBZ og FDOPA) og cerebellum (RAC), som referenceregioner.

Statistisk analyse

Sammenligninger mellem baseline- og 12-måneders opfølgningsmålinger for angst, depression, NEUROPSI, MMPSE-undersøgelser, tryk på højre og venstre finger i "ON" og "OFF" medicintilstande blev udført ved hjælp af Wilcoxon-testen. Alle andre slutmål blev rapporteret som individuelle resultater for hver patient.