Naprawa mózgu w chorobie Parkinsona przy użyciu ludzkich komórek macierzystych (HSCfPD)

Ta próba jest podłużnym, prospektywnym, interwencyjnym, niekontrolowanym badaniem mającym na celu sprawdzenie, po pierwsze, bezpieczeństwa, a po drugie, potencjalnej skuteczności przeszczepu dokręgowego niezróżnicowanego hfSC w leczeniu PD. Pacjenci byli dokładnie monitorowani pod kątem jakichkolwiek działań niepożądanych. Wszyscy pacjenci przeszli wyjściową i 6- i 12-miesięczną ocenę neurologiczną, neuropsychologiczną, MRI i PET po operacji.

Pobieranie, izolację, ekspansję i charakterystykę hfSC, jak również ocenę odpowiedzi immunologicznej pacjentów na przeszczep hfSC przeprowadzono w Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, Kalifornia, USA). Selekcja pacjentów, przed- i pooperacyjna ocena neurologiczna, neuropsychologiczna i MRI, a także chirurgia stereotaktyczna i opieka pooperacyjna zostały przeprowadzone w Hospital Angeles del Pedregal (Meksyk, Meksyk). Syntezę radiofarmaceutyków i obrazowanie PET przeprowadzono w Zakładzie Radiofarmacji-Cyklotronu Wydziału Lekarskiego Universidad Nacional Autonoma de Mexico (miasto Meksyk, Meksyk). Do tego badania wybrano ośmiu pacjentów z umiarkowaną do zaawansowanej PD. Jeden z pacjentów stracił możliwość obserwacji z przyczyn niezwiązanych z tym badaniem. Pacjenci, którzy ukończyli obserwację, to 2 kobiety i 5 mężczyzn w wieku od 43 do 74 lat (średnia wieku 56 lat).

Zakup i ekspansja hfSC

Ludzką tkankę mózgową płodu pobrano za pomocą rutynowych sterylnych ręcznych metod aspiracji za świadomą zgodą dawcy zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi stosowania tkanki płodowej, jak również przepisami federalnymi i stanowymi. Dawcy tkanek i biorcy hfSC pozostawali sobie nieznani.

Próbki krwi matki (surowice) badano na obecność: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) wirusowego zapalenia wątroby typu A, B i C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Aglutination Slide Test i odruchowa FTA) i wirus cytomegalii (Quest, Oxnard CA). Wykluczono kobiety z historią opryszczki narządów płciowych, rakiem, astmą, toczniem, reumatoidalnym zapaleniem stawów, alergiami, zapaleniem naczyń pochodzenia autoimmunologicznego i nadużywaniem narkotyków. Ciążę określono według stadiów Carnegie. Tkankę płodu pobrano w szóstym tygodniu ciąży po planowej aborcji. Mózg płodu wycięto, zmielono i roztarto do zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki hodowano w kolbach inkubowanych w temperaturze 37°C w warunkach niedotlenienia (5% O2 i 5% CO2) przez 4 podwojenia. W drugim podwojeniu (D2) hodowlę komórkową badano pod kątem sterylności (USP <71>), a w D4 hodowlę kariotypowano i testowano metodą PCR na obecność czynników przypadkowych: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), wirusowe zapalenie wątroby typu A, B i C, T. str. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Komórki następnie przeniesiono do zamkniętego układu bioreaktora (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), działającego w tych samych warunkach fizycznych i chemicznych. Bioreaktor został wykorzystany do stworzenia Master Cell Bank (MCB), który został zebrany, przetestowany, scharakteryzowany i poddany kriokonserwacji z kontrolą szybkości po łącznie siedmiu podwojeniach (D7).

Po przetestowaniu i scharakteryzowaniu MCB część partii została rozmrożona i użyta do zaszczepienia bioreaktora do produkcji Working Cell Bank (WCB). Komórki hodowano w bioreaktorze, aż osiągnęły D13. Zebrano je (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), podzielono na porcje (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) i zamrożono w celu utworzenia WCB. WCB poddano testom uwalniania pod kątem testów bezpieczeństwa i charakterystyki. Testy bezpieczeństwa obejmowały sterylność (USP <71>), mykoplazmę (USP <63), endotoksyny (USP <85>) i kariotypowanie (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Charakterystyka obejmowała badanie metodą cytometrii przepływowej dla: Oct-4 >90% (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488 skoniugowany), Sox-2 >90% (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488 skoniugowany), MHC-I <10% (A4, eBioscience; APC skoniugowany), MHC-II <10% (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; skoniugowany AF488), CD105 <10% (SN6, eBioscience; skoniugowany PE-Cy7) i hydroksylaza tyrozynowa <10% (EP1532Y, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania; skoniugowana z FITC koza anty-królicza IgG; Abcam ; poliklonalne). Zarówno MCB, jak i WCB przechowywano w fazie gazowej LN2 w -196°C.

Wszystkie procedury przeprowadzono w warunkach aseptycznych w czystym pomieszczeniu ISO 8, z wykorzystaniem szaf bezpieczeństwa biologicznego ISO 5 i kapturów z laminarnym przepływem powietrza, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Wykazano, że komórki mają prawidłowy kariotyp i nie wytwarzają potworniaków u gryzoni z obniżoną odpornością (dane niepublikowane).

Farmakoterapia

Immunosupresję za pomocą cyklosporyny A w dawce 15 mg/kg/dobę rozpoczęto 10 dni przed operacją i kontynuowano przez 1 miesiąc. Pacjenci otrzymywali również indometacynę w dawce 225 mg/dobę, zaczynając od 10 dni przed implantacją i przez sześć miesięcy po operacji. Antybiotyk o szerokim spektrum działania (Zannat 700 mg) podano przed operacją i 48 godzin po operacji. Leki przeciwparkinsonowskie dostosowano do wymagań pacjenta.

Chirurgia stereotaktyczna

Stereotaktyczną implantację komórek wewnątrzmacicznych pod kontrolą MRI pacjentom z PD przeprowadzono przy użyciu systemu stereotaktycznego Leksell i chirurgicznego systemu nawigacji Stealth Station (Fridley, Minnesota, USA). Ropiwakainę stosowano jako środek miejscowo znieczulający do zakładania ramy. W przypadku docelowych lokalizacji pomiary wykonano za pomocą obrazów tomografii komputerowej połączonych z wcześniejszymi obrazami MR (oba w formacie DICOM, w przekrojach osiowych o grubości 1,0 mm). Gdy pacjent był w znieczuleniu ogólnym, rama stereotaktyczna została przymocowana do stołu operacyjnego za pomocą uchwytu na głowę Mayfielda. Wykonano obustronne nacięcia okołostrzałkowe i odpowiadające im otwory 14 mm (po jednym na każdą półkulę) w ramach przygotowań do wstrzyknięć zawiesiny komórek. Dla każdej strony wybrano dwa różne tory igły przechodzące przez ten sam otwór. Lokalizacje docelowe określono na podstawie wysokości i długości jąder skorupowych. Najniższe współrzędne Z każdego toru znajdowały się w skorupie grzbietowej i były oddalone od siebie o 4 mm w kierunku X. Każdy ślad igły otrzymał 1X106 komórek w 1 cm3 pożywki hodowlanej. Aby zapewnić całkowite dostarczenie zawiesiny komórek, iniekcje wykonywano powoli przez 2 minuty z wycofywaniem igły do ​​podawania, aby uniknąć zarówno uszkodzenia komórek macierzystych i tkanki mózgowej, jak również zapobiec refluksowi lub tworzeniu się pęcherzyków. Po operacji pacjenci byli trzymani w konwencjonalnym oddziale opieki pooperacyjnej przez 1 godzinę. Następnego dnia po operacji uzyskano obrazy MR w celu potwierdzenia prawidłowego umieszczenia zawiesin komórek. Wszyscy chorzy zostali wypisani 24 h po operacji.

Oceny neurologiczne

Neurologiczne punkty końcowe tego badania obejmowały ocenę liczby i nasilenia zdarzeń niepożądanych po przeszczepieniu komórek oraz skuteczność poprawy odpowiedzi motorycznych, ocenianą na podstawie części I UPDRS (umysł, zachowanie i nastrój), części II (aktywność motoryczna życie codzienne), część III (sprawność motoryczna) i część IV (powikłania terapii), a także zmodyfikowana Skala Höehna i Yahra oraz zmodyfikowana Skala Czynności Codziennych Schwaba i Anglii. Pacjenci byli oceniani klinicznie za pomocą tych skal podczas badania przesiewowego (jako punkt wyjściowy, przed operacją), a następnie po zabiegu po 6 i 12 miesiącach. Podczas każdej wizyty pacjenci byli proszeni o odstawienie leków przeciw chorobie Parkinsona co najmniej 12 godzin przed oceną UPDRS (ze względów praktycznych stan „OFF” zdefiniowano jako odstawienie leku w ciągu nocy) w celu oceny stanu „OFF”, a następnie UPDRS Oceny leków „ON” przeprowadzono 1 godzinę po otrzymaniu zwykłej dawki lewodopy. Każdy pacjent otrzymał taką samą przedoperacyjną dawkę lewodopy dla każdej oceny. Rejestrowano zdarzenia niepożądane, w tym te zgłaszane przez pacjentów spontanicznie oraz obserwowane podczas ocen. Po uzyskaniu podpisanej świadomej zgody od wszystkich pacjentów, którzy ukończyli badanie, wszystkie oceny UPDRS „OFF” i „ON” zostały nagrane na wideo.

Oceny neuropsychologiczne

Funkcje poznawcze oceniano za pomocą następujących narzędzi: meksykańskie adaptacje kwestionariuszy lęku i depresji Becka i Steera [25] i depresji [26]; nasze baterie krótkich testów neuropsychologicznych (NEUROPSI)[27,28] i skomputeryzowanych testów neuropsychologicznych oraz Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Pacjenci zgłaszali jakość swojego życia w odniesieniu do ich codziennych czynności życiowych; dobre samopoczucie fizyczne i psychiczne (stan zdrowia); poznanie i komunikacja oraz jeden indeks zbiorczy.

Badanie immunogenności

Krew pacjenta oceniano pod kątem wzrostu miana przeciwciał specyficznych dla hfSC i wzrostu cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał po wszczepieniu w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Próbki pobierano miesiąc przed wszczepieniem komórek, a następnie miesiąc i sześć miesięcy po operacji. Próbki krwi pełnej pobrano od każdego pacjenta i przetworzono jako surowicę jeden i sześć miesięcy po przeszczepie przy użyciu lipofilowego barwnika błonowego PKH67 (Sigma-Aldrich), jak opisano przez producenta do śledzenia komórek w testach odpowiedzi immunologicznej i cytotoksyczności za pomocą cytometrii przepływowej [30, 31]. Test cytotoksyczności przeprowadzono przy stosunkach efektora do celu 100:1, 50:1 i 25:1.

MRI

Obrazy MR uzyskano przed operacją (linia podstawowa) i trzy razy po wszczepieniu komórek po 24 godzinach oraz sześć i 12 miesięcy po operacji. Zostały pozyskane za pomocą magnesu o mocy 3 tesli, MR Systems Achieva wydanie 2.6.3.8 Philips (Best, Holandia).

Obrazowanie molekularne PET

Pacjenci przeszli obrazowanie molekularne PET na początku badania, po sześciu miesiącach (dane nie przedstawione) i po roku od wszczepienia hfSC. Stosowanymi radiofarmaceutykami były (+)-alfa-[11C]dihydrotetrabenazyna (DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA (FDOPA) i [11C]raklopryd (RAC). Wszyscy pacjenci przeszli skany DTBZ-PET i jedno dodatkowe badanie z FDOPA lub RAC, w odstępie co najmniej jednego tygodnia. Pacjentów poproszono o przerwanie przyjmowania leków przeciw chorobie Parkinsona co najmniej 12 godzin przed każdym badaniem. Skany uzyskano na Siemens Biograph 64 PET/CT. Trzydziestominutowe skany emisji mózgu uzyskano 20 minut po wstrzyknięciu DTBZ lub RAC, podczas gdy skany 15 minut wykonano dla FDOPA 75 minut po wstrzyknięciu. Wszyscy pacjenci badani z FDOPA otrzymywali premedykację 150 mg karbidopy, aby zapobiec obwodowej dekarboksylacji. Obrazy zostały zrekonstruowane przy użyciu algorytmu OSEM-2D i przeanalizowane za pomocą oprogramowania Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Każdy pojedynczy obraz PET mózgu znormalizowano w atlasie anatomicznym MRI w celu oceny w standardowej przestrzeni. Po normalizacji atlasy strukturalne FSL zostały użyte do zdefiniowania regionów będących przedmiotem zainteresowania. Aby ułatwić analizę ilościową, obliczono współczynniki wychwytu specyficznego (SUR) w jądrze ogoniastym i skorupie, odejmując sygnał tła regionu referencyjnego z nieswoistym wychwytem od aktywności prążkowia i dzieląc przez aktywność regionu referencyjnego [(wychwyt docelowy - wychwyt referencyjny)/odniesienie wychwyt], używając kory potylicznej (DTBZ i FDOPA) i móżdżku (RAC), jako regionów odniesienia.

Analiza statystyczna

Porównania pomiarów wyjściowych i 12-miesięcznych pomiarów kontrolnych dla lęku, depresji, badań NEUROPSI, MMPSE, stukania prawym i lewym palcem w stanach lekowych „ON” i „OFF” przeprowadzono za pomocą testu Wilcoxona. Wszystkie inne pomiary końcowe zostały zgłoszone jako indywidualne wyniki dla każdego pacjenta.