Parkinsonská oprava mozku pomocí lidských kmenových buněk (HSCfPD)

Tato studie je longitudinální, prospektivní, intervenční, nekontrolovaná studie navržená tak, aby zaprvé otestovala bezpečnost a zadruhé potenciální účinnost intraputaminového štěpování nediferencovaného hfSC pro léčbu PD. Pacienti byli pečlivě sledováni z hlediska jakýchkoli nežádoucích účinků. Všichni pacienti podstoupili základní a 6 a 12 měsíců po operaci neurologické, neuropsychologické, MRI a PET vyšetření.

Získávání, izolace, expanze a charakterizace hfSC, stejně jako hodnocení imunitní odpovědi pacientů na transplantaci hfSC, byly provedeny v Celavie Biosciences, LLC (Oxnard, CA USA). Výběr pacientů, před a pooperační neurologické, neuropsychologické a MRI hodnocení, stejně jako stereotaktická chirurgie a pooperační péče, byly provedeny v Hospital Angeles del Pedregal (Mexico City, Mexiko). Syntéza radiofarmak a PET zobrazování byla provedena na Radiopharmacy-Cyclotron Unit Lékařské fakulty Universidad Nacional Autonoma de Mexico (Mexico City, Mexiko). Pro tuto studii bylo vybráno osm pacientů se středně pokročilou až pokročilou PD. Jeden z pacientů nebyl sledován z důvodů nesouvisejících s touto studií. Subjekty, které dokončily sledování, byly 2 ženy a 5 mužů s věkem v rozmezí 43-74 let (průměrný věk 56 let).

Nákup a rozšíření hfSC

Lidská fetální mozková tkáň byla získána pomocí rutinních sterilních manuálních aspiračních metod s informovaným souhlasem dárce v souladu s pokyny NIH pro použití fetální tkáně a také federálními a státními zákony. Dárce tkání a příjemci hfSC zůstali navzájem neznámí.

Vzorky mateřské krve (séra) byly testovány na: HIV (Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) hepatitidu A, B a C (Abbott); HTLVI (Abbott); VDRL (Baxter Aglutination Slide Test a reflex FTA) a cytomegalovirus (Quest, Oxnard CA). Ženy s anamnézou genitálního herpesu, rakoviny, astmatu, lupusu, revmatoidní artritidy, alergií, vaskulitidy autoimunitního původu a abúzu drog byly vyloučeny. Těhotenství bylo určeno podle Carnegieho stádií. Fetální tkáň byla odebrána v šestém týdnu gestace po elektivním potratu. Fetální mozek byl vypreparován, rozemlet a triturován na jednobuněčnou suspenzi. Buňky byly kultivovány v baňkách inkubovaných při 37 °C za hypoxických podmínek (5 % 02 a 5 % C02) prostřednictvím 4 zdvojení. Při druhém zdvojení (D2) byla buněčná kultura testována na sterilitu (USP <71>) a v kultuře D4 byla provedena karyotypizace a PCR testována na přítomnost cizích agens: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1 (A, B, D, F, H, N), hepatitida A, B a C, T. p. pallidum, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. Buňky byly poté přeneseny do uzavřeného bioreaktorového systému (GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE), pracujícího za stejných fyzikálních a chemických podmínek. Bioreaktor byl použit k vytvoření Master Cell Bank (MCB), která byla sklizena, testována, charakterizována a kryokonzervována s kontrolou rychlosti po celkem sedmi zdvojení (D7).

Poté, co byl MCB testován na bezpečnost a charakterizován, byla část šarže rozmražena a použita k naočkování bioreaktoru pro výrobu Working Cell Bank (WCB). Buňky byly kultivovány v bioreaktoru, dokud nedosáhly D13. Byly sklizeny (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), rozděleny na alikvoty (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) a kryokonzervovány za účelem vytvoření WCB. WCB bylo podrobeno zkouškám na uvolňování pro bezpečnostní a charakterizační testy. Testování bezpečnosti zahrnovalo sterilitu (USP <71>), mykoplazma (USP <63), endotoxin (USP <85>) a karyotypizaci (Cell Line Genetics, Madison WI, USA). Charakterizace zahrnovala testování průtokovou cytometrií pro: Oct-4 >90 % (10H11.2, EMD Millipore, Billerica, MA, USA; AF488 konjugovaný), Sox-2 >90 % (Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA; AF488 konjugovaný), MHC-I <10 % (A4, eBioscience; APC konjugovaný), MHC-II <10 % (CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA; AF488 konjugovaný), CD105 <10 % (SN6, eBioscience; PE-Cy7 konjugovaný) a tyrosinhydroxyláza <10 % (EP1532Y, Abcam, Cambridge, UK; FITC konjugovaný kozí anti-králičí IgG; Abcam polyklonální). MCB i WCB byly skladovány v plynné fázi LN2 při -196 °C.

Všechny procedury byly prováděny za aseptických podmínek v čisté místnosti ISO 8, s využitím boxů pro biologickou bezpečnost ISO 5 a digestoří s laminárním prouděním vzduchu, podle ověřených protokolů. Bylo prokázáno, že buňky mají normální karyotyp a nevytvářely teratomy u imunokompromitovaných hlodavců (nepublikovaná data).

Farmakoterapie

Imunosuprese prostřednictvím cyklosporinu A v dávce 15 mg/kg/den byla zahájena 10 dní před operací a pokračovala jeden měsíc poté. Pacienti také dostávali Indomethacin 225 mg/den, počínaje 10 dny před implantací a po dobu šesti měsíců po operaci. Předoperačně a 48 hodin po operaci bylo podáváno širokospektré antibiotikum (Zannat 700 mg). Antiparkinsonika byla upravena podle požadavků pacienta.

Stereotaktická chirurgie

Implantace stereotaktických intraputaminových buněk řízená MRI pacientům s PD byla provedena pomocí stereotaktického systému Leksell a chirurgického navigačního systému Stealth Station (Fridley, Minnesota, USA). Ropivakain byl použit jako lokální anestetikum pro umístění rámu. Pro cílové polohy byla měření provedena pomocí CT snímků spojených s předchozími snímky MR (oba ve formátu DICOM, v axiálních řezech o tloušťce 1,0 mm). U pacienta v celkové anestezii byl stereotaktický rám fixován k operačnímu stolu pomocí Mayfieldova držáku hlavy. Bilaterální parasagitální řezy a odpovídající 14mm otvory pro otřepy (jeden pro každou hemisféru) byly provedeny jako příprava pro injekce buněčné suspenze. Pro každou stranu byly vybrány dvě různé dráhy jehly procházející stejným otvorem pro otřepy. Cílová umístění byla určena výškou a délkou putaminálních jader. Nejnižší Z-souřadnice každé dráhy se nacházely v dorzálním putamenu a byly od sebe vzdáleny 4 mm ve směru X. Každá dráha jehly obdržela 1 x 106 buněk v 1 cm3 kultivačního média. Aby se zajistilo úplné dodání buněčné suspenze, byly injekce prováděny pomalu po dobu 2 minut s recipročním vytažením zaváděcí jehly, aby se zabránilo poškození kmenových buněk a mozkové tkáně a také aby se zabránilo refluxu nebo tvorbě bublin. Po operaci byli pacienti 1 hodinu drženi na klasické pooperační jednotce. Den po operaci byly získány MR snímky pro potvrzení správného umístění buněčných suspenzí. Všichni pacienti byli propuštěni 24 hodin po operaci.

Neurologická vyšetření

Neurologické koncové body této studie zahrnovaly hodnocení počtu a závažnosti nežádoucích účinků po transplantaci buněk a účinnost při zlepšení motorických odpovědí, jak bylo hodnoceno na UPDRS část I (mentace, chování a nálada), část II (motorické aktivity každodenní život), část III (motorický výkon) a část IV (komplikace terapie), stejně jako upravená Höehnova a Yahrova škála a modifikovaná Schwabova a Englandova škála činností. Pacienti byli klinicky hodnoceni pomocí těchto škál při screeningu (jako výchozí, před operací) a poté po výkonu v 6 a 12 měsících. Při každé návštěvě byli pacienti požádáni, aby vysadili antiparkinsoniku alespoň 12 hodin před hodnocením UPDRS (pro praktické účely byl stav „OFF“ definován jako vysazení léku přes noc), aby byli hodnoceni ve stavu „OFF“ a poté UPDRS Hodnocení "ON" medikace bylo provedeno 1 hodinu po podání jejich obvyklé dávky levodopy. Každý pacient dostal stejnou předoperační dávku levodopy pro každé hodnocení. Byly zaznamenány nežádoucí příhody, včetně těch, které pacienti hlásili spontánně a těch, které byly pozorovány během hodnocení. Po získání podepsaného informovaného souhlasu od všech pacientů, kteří dokončili studii, byla všechna „OFF“ a „ON“ hodnocení UPDRS natočena na video.

Neuropsychologická vyšetření

Kognitivní výkonnost byla hodnocena pomocí následujících nástrojů: mexické adaptace inventářů úzkosti Becka a Steera [25] a deprese [26]; naše krátké neuropsychologické (NEUROPSI)[27,28] a počítačové baterie neuropsychologických testů a Mini-mental Parkinson State Examination (MMPSE)[29]. Pacienti uváděli kvalitu svého života ve vztahu k jejich každodenním životním aktivitám; fyzická a duševní pohoda (zdravotní stav); poznávání a komunikace a jeden souhrnný rejstřík.

Testování imunogenicity

Krev pacienta byla hodnocena na zvýšení titrů hfSC specifických protilátek a na zvýšení na protilátkách závislé buňkami zprostředkované cytotoxicity po implantaci ve srovnání se základními hodnotami. Vzorky byly odebrány jeden měsíc před implantací buněk a poté jeden měsíc a šest měsíců po operaci. Od každého pacienta byly odebrány vzorky plné krve a zpracovány jako sérum jeden a šest měsíců po transplantaci pomocí lipofilního membránového barviva PKH67 (Sigma-Aldrich), jak je popsáno výrobcem pro sledování buněk v testech imunitní odpovědi a cytotoxicity pomocí průtokové cytometrie [30, 31]. Test cytotoxicity byl proveden s poměry efektoru k cíli 100:1, 50:1 a 25:1.

MRI

MR snímky byly získány před operací (základní hodnota) a třikrát po implantaci buněk za 24 hodin a šest a 12 měsíců po operaci. Byly získány s magnetem 3 Tesla, vydání MR Systems Achieva 2.6.3.8 Philips (Best, Nizozemsko).

PET molekulární zobrazování

Pacienti podstoupili PET molekulární zobrazení na začátku, po šesti měsících (data nejsou uvedena) a jeden rok po implantaci hfSC. Použitá radiofarmaka byla (+)-alfa-[11C]dihydrotetrabenazin (DTBZ), 6-[18F]fluor-L-DOPA (FDOPA) a [11C]racloprid (RAC). Všichni pacienti podstoupili skenování DTBZ-PET a jednu další studii s FDOPA nebo RAC s odstupem alespoň jednoho týdne. Pacienti byli požádáni, aby vysadili antiparkinsoniku alespoň 12 hodin před každou studií. Skenování bylo pořízeno na Siemens Biograph 64 PET/CT. Třicetiminutové skeny mozkové emise byly pořízeny 20 minut po injekci DTBZ nebo RAC, zatímco 15 minutové skeny byly pořízeny pro FDOPA 75 minut po injekci. Všichni pacienti studovaní s FDOPA byli premedikováni 150 mg karbidopy k prevenci periferní dekarboxylace. Snímky byly rekonstruovány pomocí algoritmu OSEM-2D a analyzovány pomocí softwaru Statistical Parametric Mapping (SPM v.12). Každý jednotlivý PET obraz mozku byl normalizován na anatomickém MRI atlasu, aby byl hodnocen ve standardním prostoru. Po normalizaci byly pro definici oblastí zájmu použity strukturní atlasy FSL. Pro usnadnění kvantitativní analýzy byly vypočteny specifické poměry vychytávání (SUR) v caudate a putamen odečtením signálu pozadí referenční oblasti s nespecifickým vychytáváním od striatální aktivity a dělením aktivitou referenční oblasti [(cílový příjem - referenční příjem)/referenční příjem], za použití okcipitální kůry (DTBZ a FDOPA) a mozečku (RAC), jako referenčních oblastí.

Statistická analýza

Srovnání mezi výchozím a 12měsíčním následným měřením úzkosti, deprese, vyšetření NEUROPSI, MMPSE, poklepávání pravým a levým prstem v medikačních stavech „ON“ a „OFF“ bylo provedeno pomocí Wilcoxonova testu. Všechna ostatní koncová měření byla uvedena jako individuální výsledky pro každého pacienta.