인간 줄기 세포를 사용한 파킨슨병 뇌 복구 (HSCfPD)

이 시험은 파킨슨병 치료를 위한 미분화 hfSC의 경피내 이식의 잠재적 효능과 안전성을 테스트하기 위해 고안된 종단적, 전향적, 중재적, 통제되지 않은 연구입니다. 부작용에 대해 환자를 주의 깊게 모니터링했습니다. 모든 환자는 기준선과 수술 후 6개월 및 12개월 신경학적, 신경심리학적, MRI 및 PET 평가를 받았습니다.

hfSC의 조달, 분리, 확장 및 특성화뿐만 아니라 hfSC 접목에 대한 환자의 면역 반응 평가는 Celavie Biosciences, LLC(Oxnard, CA USA)에서 수행되었습니다. 앙헬레스 델 페드레갈 병원(멕시코 멕시코시티)에서 환자 선택, 수술 전후 신경학적, 신경심리학적, MRI 평가, 정위 수술 및 수술 후 관리를 수행했습니다. 방사성 의약품의 합성 및 PET 이미징은 멕시코 국립 자치 대학교(멕시코 멕시코 시티) 의학부의 방사성 약학-사이클로트론 단위에서 수행되었습니다. 중등도 내지 진행성 PD를 가진 8명의 환자가 이 시험을 위해 선택되었습니다. 환자 중 한 명은 이 연구와 관련 없는 이유로 인해 후속 조치를 받지 못했습니다. 추적관찰을 마친 대상자는 여성 2명, 남성 5명이었고, 연령은 43-74세(평균 56세)였다.

hfSC 조달 및 확장

인간 태아 뇌 조직은 연방 및 주법뿐만 아니라 태아 조직 사용에 대한 NIH 지침에 따라 기증자의 정보에 입각한 동의하에 일상적인 멸균 수동 흡인 방법을 통해 조달되었습니다. 조직 기증자와 hfSC 수혜자는 서로 알려지지 않았습니다.

모체 혈액 샘플(혈청)은 HIV(Abbott Laboratories, Abbott Park IL, USA) A형, B형 및 C형 간염(Abbott); HTLVI(애보트); VDRL(Baxter Agglutination Slide Test and reflex FTA) 및 사이토메갈로바이러스(Quest, Oxnard CA). 생식기 포진, 암, 천식, 루푸스, 류마티스 관절염, 알레르기, 자가면역성 혈관염 및 약물 남용의 병력이 있는 여성은 제외되었습니다. 임신은 Carnegie 단계에 따라 결정되었습니다. 선택적 낙태 후 임신 6주차에 태아 조직을 채취했습니다. 태아 뇌를 해부하고 다진 다음 분쇄하여 단일 세포 현탁액으로 만들었습니다. 세포는 저산소 조건(5% O2 및 5% CO2) 하에 37℃에서 4번의 배가를 통해 배양된 플라스크에서 배양되었다. 두 번째 배가(D2)에서 세포 배양은 무균(USP <71>)에 대해 테스트되었고 D4 배양에서는 핵형이 분석되었으며 우발성 인자의 존재에 대해 PCR 테스트가 수행되었습니다: HTLV-1, HTLV-2, HIV-1(A, B, D, F, H, N), A형, B형 및 C형 간염, T. p. 팔리듐, CMV, HSV-1, HSV-2, HPV. 그런 다음 세포를 동일한 물리적 및 화학적 조건에서 작동하는 폐쇄형 생물 반응기 시스템(GE WAVE Bioreactor 2/10 System, Uppsala SWE)으로 옮겼습니다. 생물반응기를 사용하여 총 7번의 배가(D7) 후에 수확, 테스트, 특성화 및 속도 제어 동결 보존된 마스터 세포 은행(MCB)을 생성했습니다.

MCB의 안전성 테스트 및 특성화 후, 배치의 일부를 해동하여 WCB(Working Cell Bank) 생산을 위한 생물 반응기에 시딩하는 데 사용했습니다. 세포를 D13에 도달할 때까지 생물반응기에서 배양하였다. 그들은 수확 (Centritech LAB-III, Carr Centritech Separation System, Rancho Cucamonga, CA, USA), 분주 (Fill-It; TAP Biosystems, Wilmington, DE, USA) 및 동결 보존되어 WCB를 생성했습니다. WCB는 안전성 및 특성 분석을 위한 방출 테스트를 거쳤습니다. 안전성 테스트에는 불임(USP <71>), 마이코플라즈마(USP <63), 내독소(USP <85>) 및 핵형 분석(Cell Line Genetics, Madison WI, USA)이 포함되었습니다. 특성화에는 다음에 대한 유세포분석 테스트가 포함됨: Oct-4 >90%(10H11.2, EMD 밀리포어(EMD Millipore), 미국 메사추세츠주 빌레리카; AF488 접합), Sox-2 >90%(Btjce, eBioscience, San Diego CA, USA, AF488 접합), MHC-I <10%(A4, eBioscience, APC 접합), MHC-II <10%(CVS20, Novus Biologicals, Littleton CO, USA, AF488 접합), CD105 <10%(SN6, eBioscience; PE-Cy7 접합) 및 티로신 수산화효소 <10%(EP1532Y, Abcam, 영국 케임브리지, FITC 접합 염소 항토끼 IgG, Abcam ; 다클론성). MCB와 WCB는 모두 -196°C에서 기상 LN2에 저장되었습니다.

모든 절차는 검증된 프로토콜에 따라 ISO 5 바이오 안전 캐비닛과 층류 후드를 활용하여 ISO 8 클린룸의 무균 조건에서 수행되었습니다. 세포는 정상적인 핵형을 갖는 것으로 나타났으며 면역손상된 설치류에서 기형종을 생성하지 않았습니다(미공개 데이터).

약물 요법

15 mg/kg/day 용량의 사이클로스포린 A를 통한 면역 억제는 수술 10일 전에 시작하여 그 후 1개월 동안 계속되었습니다. 환자들은 또한 이식 10일 전부터 수술 후 6개월 동안 Indomethacin 225mg/일을 투여 받았습니다. 광범위 항생제(Zannat 700mg)를 수술 전과 수술 후 48시간에 투여했습니다. 항파킨슨병 약물은 환자의 요구 사항에 맞게 조정되었습니다.

정위 수술

Leksell Stereotactic System 및 Stealth Station Surgical Navigation System (Fridley, Minnesota, USA)을 사용하여 PD 환자에게 MRI 유도 정위 경피내 세포 이식을 수행했습니다. Ropivacaine은 프레임 배치를 위한 국소 마취제로 사용되었습니다. 대상 위치의 경우 이전 MR 이미지와 융합된 CT 스캔 이미지를 사용하여 측정했습니다(둘 다 DICOM 형식, 1.0mm 두께의 축 단면). 환자를 전신 마취한 상태에서 정위 프레임을 Mayfield 헤드 홀더로 수술대에 고정했습니다. 양측 parasagittal 절개 및 해당 14mm 버 구멍 (각 반구에 하나씩)이 세포 현탁액 주입을 준비하기 위해 만들어졌습니다. 동일한 버 구멍을 통과하는 두 개의 다른 바늘 트랙이 각 측면에 대해 선택되었습니다. 대상 위치는 경피핵의 높이와 길이로 결정하였다. 각 트랙의 가장 낮은 Z 좌표는 등쪽 조가비에 위치하고 X 방향으로 4mm 간격을 두었습니다. 각 바늘 트랙은 1cc의 배양 배지에 1X106 세포를 수용했습니다. 완전한 세포 현탁액 전달을 보장하기 위해, 줄기 세포 및 뇌 조직의 손상을 방지하고 역류 또는 기포 형성을 방지하기 위해 전달 바늘을 2분 동안 천천히 주사하였다. 수술 후 환자는 1시간 동안 기존의 수술 후 관리실에 보관되었습니다. 수술 다음 날, 세포 현탁액의 정확한 배치를 확인하기 위해 MR 이미지를 얻었다. 모든 환자는 수술 후 24시간 후에 퇴원하였다.

신경학적 평가

이 연구의 신경학적 종료점에는 세포 이식 후 이상 반응의 수와 심각도 평가, UPDRS 파트 I(정신, 행동 및 기분), 파트 II(인간의 운동 활동 일상 생활), 파트 III(운동 수행), 파트 IV(치료의 합병증), Modified Höehn and Yahr Scale, Modified Schwab and England Activities of the Daily Living Scale. 환자들은 스크리닝 시(기준선으로, 수술 전), 시술 후 6개월 및 12개월에 이러한 척도를 사용하여 임상적으로 평가되었습니다. 방문할 때마다 환자는 UPDRS 평가 최소 12시간 전에 항파킨슨병 약물을 중단하도록 요청받았습니다(실제적인 목적을 위해 "OFF" 상태는 밤새 약물 중단으로 정의됨). "ON" 약물 평가는 레보도파의 일반적인 복용량을 받은 후 1시간 후에 수행되었습니다. 각 환자는 각 평가에 대해 동일한 수술 전 레보도파 용량을 받았습니다. 환자가 자발적으로 보고한 부작용과 평가 중에 관찰된 부작용을 포함하여 부작용을 기록했습니다. 연구를 완료한 모든 환자로부터 서명된 사전 동의를 얻은 후, 모든 "OFF" 및 "ON" UPDRS 평가를 비디오로 녹화했습니다.

신경심리학적 평가

다음 도구를 사용하여 인지 성능을 평가했습니다: Beck과 Steer의 불안[25] 및 우울증[26] 인벤토리의 멕시코 적응; 우리의 간략한 신경 심리학(NEUROPSI)[27,28] 및 전산화된 신경 심리학 테스트 배터리, 간이 정신 파킨슨 상태 검사(MMPSE)[29]. 환자들은 일상 생활 활동과 관련된 삶의 질에 대해 보고했습니다. 신체적, 정신적 웰빙(건강 상태); 인지 및 의사소통, 그리고 하나의 요약 색인.

면역원성 시험

hfSC 특이적 항체 역가의 증가와 기준선 값과 비교하여 이식 후 항체 의존성 세포 매개 세포독성의 증가에 대해 환자의 혈액을 평가했습니다. 세포 이식 1개월 전과 수술 1개월 및 6개월 후에 샘플을 채취했습니다. 각 환자로부터 전혈 표본을 채취하여 유세포 분석법에 의한 면역 반응 및 세포 독성 분석에서 세포 추적을 위해 제조업체에서 설명한 대로 친유성 막 염료 PKH67(Sigma-Aldrich)을 사용하여 이식 1개월 및 6개월 후 혈청으로 처리했습니다[30, 31]. 세포독성 분석은 100:1, 50:1 및 25:1 이펙터 대 표적 비율로 수행되었습니다.

MRI

MR 이미지는 수술 전(기준선)과 세포 이식 후 24시간, 수술 후 6개월 및 12개월에 3회 획득되었습니다. 그들은 3 Tesla 자석, MR Systems Achieva 릴리스 2.6.3.8로 획득했습니다. 필립스(베스트, 네덜란드).

PET 분자 이미징

환자들은 기준선, 6개월(데이터는 제시되지 않음) 및 hfSC 이식 후 1년에 PET 분자 이미징을 받았습니다. 사용된 방사성 의약품은 (+)-alpha-[11C]Dihidrotetrabenazine(DTBZ), 6-[18F]Fluoro-L-DOPA(FDOPA) 및 [11C]Raclopride(RAC)였습니다. 모든 환자는 최소 일주일 간격으로 DTBZ-PET 스캔과 FDOPA 또는 RAC로 한 가지 추가 연구를 받았습니다. 환자들은 각 연구 최소 12시간 전에 항파킨슨병 약물을 중단하도록 요청받았습니다. Siemens Biograph 64 PET/CT에서 스캔을 획득했습니다. DTBZ 또는 RAC 주입 후 20분에 30분 뇌 방출 스캔을 획득한 반면, 주입 후 75분에 FDOPA에 대해 15분 스캔을 획득했습니다. FDOPA로 연구된 모든 환자는 말초 탈카르복실화를 방지하기 위해 150mg의 카르비도파로 사전 투약되었습니다. OSEM-2D 알고리즘을 사용하여 이미지를 재구성하고 소프트웨어 Statistical Parametric Mapping(SPM v.12)으로 분석했습니다. 각각의 개별 PET 뇌 영상은 해부학적 MRI 아틀라스에서 정규화되어 표준 공간 내에서 평가되었습니다. 정규화 후 FSL 구조 아틀라스는 관심 영역의 정의에 사용되었습니다. 정량 분석을 용이하게 하기 위해 선조체 활성에서 비특이적 흡수가 있는 참조 영역의 배경 신호를 빼고 참조 영역 활성으로 나누어 미상 및 조가비의 특정 흡수 비율(SUR)을 계산했습니다. 섭취], 후두 피질(DTBZ 및 FDOPA) 및 소뇌(RAC)를 참조 영역으로 사용합니다.

통계 분석

Wilcoxon 테스트를 사용하여 불안, 우울증, NEUROPSI, MMPSE 검사, "ON" 및 "OFF" 투약 상태에서 오른쪽 및 왼쪽 손가락 탭핑에 대한 기준선과 12개월 추적 측정 간의 비교를 수행했습니다. 다른 모든 최종 측정은 각 환자에 대한 개별 결과로 보고되었습니다.