腹部癌手術に関連した免疫学的および酸化ストレス反応 (IMOX)

バックグラウンド

周術期の期間は比較的短いですが、がん関連の生存にとって非常に重要です。 外科的処置により、腫瘍細胞が局所的および血液中に放出され、外科的ストレス反応（SSR）が誘発されます。 これにより、免疫系が麻痺し、がん細胞の除去が減少し、がん細胞の増殖と転移に最適な条件がもたらされます(1)。

結腸直腸がん (CRC) は、デンマークにおけるがんの原因として 3 番目に多いものです。 2013 年にデンマークでは 4,196 人の患者が大腸がんと診断され(2)、現在の標準治療には腫瘍切除が含まれています。 しかし、治癒が期待される外科的腫瘍切除後でも、最初の手術後 5 年以内に 25 ～ 30% が再発します。

がん手術後の転帰を改善するには、SSR が免疫応答にどのような影響を与えるか、また SSR ががん細胞の増殖および転移能力にどのような影響を与えるかを詳細に理解することが重要です。 手術の前後に全血中の 40,000 を超える遺伝子の発現プロファイリングを実行することで、顆粒球、単球、B 細胞と T 細胞、樹状細胞、血小板を含む循環免疫細胞から遺伝子の遺伝的特徴を取得します。手術がこれらの免疫学的因子の遺伝子転写に与える正確な影響をご覧ください。 この情報を使用することで、周術期の免疫反応を最適化する周術期介入を実行でき、がん再発リスクの低減とその結果としての生存率の向上につながります (3)。

外科的ストレス反応 (SSR) 外科的処置が免疫学的および炎症性バランスの乱れを誘発し、全身性炎症反応 (4)、免疫抑制 (4,5)、および過剰な活性酸素種 (ROS) (6) を引き起こすことはよく知られています。 、7）。 全身性炎症は腫瘍の増殖を促進し (8)、治癒の可能性がある結腸直腸癌の切除を受けた患者では、全身性炎症反応の存在により予後不良が予測されます (3)。 免疫系の麻痺には、NK 細胞とマクロファージの活性低下が含まれます。これらは通常の状況下では、播種中の腫瘍細胞を排除することで転移を防ぎます。 過剰な ROS は DNA 損傷、細胞外マトリックスの破壊、細胞間の接着の除去を引き起こします (5、6、7)。 このようにして、手術は、術後の段階でがん細胞が増殖し転移するための最適な条件を促進します。 最近の研究では、免疫細胞とその原発腫瘍への浸潤が患者の予後と相関していることが示されており、免疫応答が癌増殖の阻害に重要であることが再び示唆されています(9,10)。 手術による免疫反応のさまざまな要因における遺伝子変化の詳細な情報は依然として不明です。

研究デザイン このプロジェクトは、結腸癌のため待機的半結腸切除術を受ける 30 人の患者を含む臨床前向き探索研究で構成されています。UICC スタジアム II ～ III。 血液サンプルは手術の前日と手術後 1、2、3、10 日目に採取されます。 サンプルはフローサイトメトリー分析、バイオバンキング、凍結保存、全血ゲノムプロファイリング用に準備されます。

全血遺伝子発現プロファイリングが実行され、手術によって引き起こされる免疫学的、炎症性、酸化ストレス関連因子をコードする遺伝子の転写変化の可能性を判断するために分析されます。 これらの遺伝的変化の定量的測定と定性的測定の両方を行うことが可能です (11)。手術の前後で最も有意に差次的に発現することが判明したプローブセットが、さらなる分析のために選択されます。 炎症、免疫学的ストレス、酸化ストレスの分野で、以前の研究で報告されている、大幅に調節が解除されている遺伝子が、さらなる分析のために選択されることになる。 免疫学および炎症における正確な遺伝子の例は、TNFα、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、TGFβ、および HLA-G をコードする遺伝子です。 酸化遺伝子と抗酸化遺伝子のうち、FoxO3、TP53、および ATM は、これらの不活性化が ROS レベルの増加に関連しているため、特に重点が置かれます。 ATOX1、DEFB122、および GBX8 の上方制御は ROS レベルの増加と関連しており、これもさらなる分析のために選択されます (19-21)。

特定の炎症性および免疫調節タンパク質 (TNFα、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、TGFβ、および HLA-G)、ナチュラルキラー (NK) 細胞の機能活性、および分画の変化および免疫細胞の特定の部分集団の絶対数（CD3+CD4+、CD3+CD8+、FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim 制御性 T 細胞、CD4+HLA-G+ 制御性 T 細胞、骨髄由来サプレッサー細胞および NK サブセット） ）が特定されます。 遺伝子転写分析の結果と、炎症性および免疫調節タンパク質の変化の分析の結果は、SSR の完全な概要と、潜在的な発がん性を評価するために免疫学的、酸化的および炎症性因子に対する手術の影響を与えるために比較されます。手術の効果、この有害なプロセスへの最適な介入の時間と方法。

登録された 30 人の患者からの腫瘍サンプルは、免疫細胞の浸潤レベルについて分析されます。 この結果は、遺伝子発現プロファイリングの結果と、手術前に全血サンプルで測定された炎症性および免疫調節タンパク質の分析の結果と相関します。 免疫組織化学が実施され、クリントラップ法 (12) および免疫スコア (13) に従って腫瘍の炎症性浸潤が評価されます。 これらの方法は、ヘマトキシリンおよびエオシンのスライドから特定される炎症細胞の浸潤の最深点を定義するスコアリング システムに基づいています。

メソッド

全血遺伝子発現プロファイリング:

血液サンプルは PAX 遺伝子チューブに収集され、オーデンセ大学病院臨床遺伝学部に分析のために送られます。 全 RNA は Paxgene Blood RNA キット (Qiagen、米国ニュージャージー州フランクリン レイクス) を使用して抽出され、RNA の品質は Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies、カリフォルニア州パロアルト) を使用してテストされます。 Message-AmpTM III RNA 増幅キット (Ambion、テキサス州オースティン) を使用して、全 RNA をビオチン標識 aRNA に変換します。 標識された aRNA は、Affymetrix HGU133 Plus 2.0 チップにハイブリダイズされます。 データの前処理は、堅牢なマルチアレイ平均発現測定 (rma) を使用して R 環境で行われ、すべてのマイクロアレイのバックグラウンド補正、正規化、発現指数計算が実行されます。 さらに高度な分析には、教師ありメソッドと教師なしメソッドを含む高次元データの高度なメソッドが含まれます。 倍率変化が計算され、マイクロアレイ (SAM) の有意性分析と t 検定が差次的に発現された遺伝子を特定するために使用され、サンプルと複数の仮説検定の補正が FDR 法を使用して実行されます。 経路分析は、遺伝子セット濃縮分析 (GSEA、Broad Institute) を使用して、外科的操作によって活性化される生物学的メカニズムを特定するために適用されます。

炎症マーカーおよび免疫学的マーカーの評価:

すべてのサンプルが収集されたら、バイオバンクに保存された血漿と血清の一部は、TNFα、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、VEGF、TGFβ、および HLA-G の濃度の測定に使用されます。ロスキレ病院の BEP2000 ELISA 装置 (Siemens Healthcare、エアランゲン、ドイツ) での ELISA 臨床生化学では、これらの対策について豊富な経験があります。

白血球部分集団の分析:

白血球部分集団のマルチカラー免疫表現型検査は、血液サンプルの採取後 1 ～ 2 時間以内に実行されます。 分析は、BD FACS Canto II 機器 (BD Biosciences、ニュージャージー、米国) を使用して行われます。 この機器はチューブごとに 8 つの色/マーカーを分析します。 特異的マーカーパネルの使用により、CD3+CD4+、CD3+CD8+、FoxP3+ / CD4+CD25+CD127 /dim 制御性 T 細胞、CD4+HLA-G+ 制御性 T 細胞、骨髄由来サプレッサー細胞および NK サブセットが同定されます。 結果は、手術の前日から手術後 10 日までの期間における炎症および免疫学的アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに従って分析されます。

腫瘍標本の免疫組織化学的分析:

すべてのサンプルが収集されたら、免疫組織化学が実行されます。 浸潤の深さと、CD4、CD8、CD45RO、および GZMB を発現する細胞の数が分析されます。 分析は、0 ～ 3 の範囲のスコアリング方法であるクリントラップ法に従って実行されます。 スコア 0 は、腫瘍浸潤縁の最深部で炎症細胞が増加していないことを示します。 1 は、穏やかで斑状の増加を示します。 2 は顕著な炎症反応を示し、3 は癌細胞島の頻繁な破壊を伴う浸潤端の鮮やかなカップ状の炎症性浸潤を示します。 これらのスコアは、低グレード (0 および 1) と高グレード (2 および 3) に分類されます。

NK 細胞 PBMC を凍結保存して単離した後、NK 細胞をクロム標識した NK 感受性標的細胞に曝露することにより、インビトロで NK 細胞の機能活性を測定します。 このアッセイでは、NK 細胞の溶解標的から放出されたクロムを測定することにより、NK 細胞の活性を定量化します。